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Zusammenfassung:
Das Existieren von Signalwegen innerhalb einer Zelle sowie zwischen verschiedenen Zellen ist unabdingbar für das Überleben aller mehrzelliger Organismen. Sie ermöglichen eine suffiziente Adaptation jeder einzelnen Zelle an wechselnde äußere Bedingungen. In der Literatur sind eine Vielzahl unterschiedlicher Mechanismen beschrieben, die eine Zelle dazu befähigen, extrazelluläre Signale in das Innere der Zelle zu leiten. Ein in den letzten Jahren intensiv untersuchter Signalübertragungsmechanismus ist der sogenannte JAK-STAT-Signalweg. Dieser Signalweg ermöglicht einer Zelle, extrazelluläre Informationen zu erkennen und bis in ihren Kern fortzuleiten. Zunächst erkennen zellmembranständige Rezeptoren extrazelluläre Signale in Form von Zytokinen wie Interleukine und Interferone. Diese aktivieren an den Rezeptor gebundene, intrazelluläre Januskinasen (JAK). Im nächsten Schritt katalysieren die JAKs die Tyrosin-Phosphorylierung der STAT-Proteine (Signal Transducers and Activators of Transcription), welche anschließend dimerisieren. Die dimerisierten STAT-Moleküle erkennen spezifische Promotorregionen ihrer Zielgene und bewirken schließlich eine Modifikation der Transkription der entsprechenden Gene. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung konservierter Aminosäurereste in der aminoterminalen Coiled-coil-Domäne des STAT1-Proteins untersucht. Dazu wurden Punktmutationen als Alanin-Scans an den Stellen 136, 137, 138, 139 und 143 sowie eine doppelte Punktmutation 136/137 mittels Mutagenese in ein STAT1-kodierendes Plasmid eingeführt. Auf diese Weise konnten mutierte STAT1-Proteine gewonnen werden, die mithilfe von Fluoreszenzmikroskopie, Western-Blot-, Reportergen-, Gel-Shift- und RT-PCR-Versuchen charakterisiert wurden. Die Ergebnisse der durchgeführten Versuche zeigten keine signifikanten Unterschiede im Vergleich der untersuchten Mutanten mit dem Wildtyp. Dies legt nahe, dass ein Austausch der beschriebenen Aminosäuren in der Coiled-coil-Domäne die funktionelle Integrität von STAT1 bei der Interferonantwort nicht eingeschränkt. Die im Rahmen dieser Arbeit festgestellten Ergebnisse werden durch Arbeiten anderer Autoren bestätigt (Mertens et al., 2006). Sie konnten unter anderem zeigen, dass die konkrete Abfolge der Aminosäuren dieser Sequenz nicht von entscheidender Bedeutung ist und auch ein umfangreicher Austausch von Aminosäuren die regelrechte Signaltransduktion nicht beeinträchtigt. Eine starke Kürzung der Sequenz führt jedoch in entsprechenden Experimenten zu einer persistierenden Phophorylierung von STAT1. Es ist daher anzunehmen, dass die funktional intakte Coiled-coil-Domäne notwendige Voraussetzung für die Umlagerung der Konformation von phosphorylierten STAT1-Dimeren ist. Diese Konformationsänderung ist erforderlich, um das phosphorylierte STAT1 einer Dephosphorylierung und damit der Beendigung der Signalübertragung zugänglich zu machen. Für die Funktion des Proteins scheint daher die Coiled-coil-Domäne mit ihren Eigenschaften als ausreichend lange und flexible Kette von Aminosäuren von großer Bedeutung zu sein. Einzelne Aminosäuren können in dieser Kette aber ohne Folgen ausgetauscht werden.

Bibliographie / References

1. Meyer,T., Gavenis,K. and Vinkemeier,U. (2002b) Cell type-specific and tyrosi ne phosphorylation-independent nuclear presence of STAT1 and STAT3.
2. Mao, X., Ren, Z., Parker, G.N., Sondermann, H., Pastorello, M.A., Wang, W., McMurray, J.S., Demeler, B., Darnell, J.E. Jr., Chen, X. (2005) Structural ba ses of unphosphorylated STAT1 association and receptor binding. Mol Cell 17, 761-71.
3. Sekimoto, T., Nakajima, K., Tachibana, T., Hirano, T., Yoneda, Y. (1996) Inter ferongamma-dependent nuclear import of Stat1 is mediated by the GTPase activity of Ran/TC4. J Biol Chem 271, 31017-31020.
4. Pfaffl, M.W. (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 29, e45.
5. Sekimoto, T., Imamoto, N., Nakajima, K., Hirano, T., Yoneda, Y. (1997) Extra cellular signal-dependent nuclear import of Stat1 is mediated by nuclear po re-targeting complex formation with NPI-1, but not Rch1. EMBO J 16, 7067- 7077.
6. Meyer, T., Begitt, A., Lödige, I., van Rossum, M., Vinkemeier, U. (2002a) Constitutive and IFN-gamma-induced nuclear import of STAT1 proceed through independent pathways. EMBO J 21, 344-354.
7. Mertens, C., Zhong, M., Krishnaraj, R., Zou, W., Chen, X., Darnell, J.E. Jr. (2006) Dephosphorylation of phosphotyrosine on STAT1 dimers requires ex tensive spatial reorientation of the monomers facilitated by the N-terminal do main. Genes Dev 20, 3372-3381.
8. Lödige, I., Marg, A., Wiesner, B., Malecová, B., Oelgeschläger, T., Vinkemei er, U. (2005) Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT tran scription factors. J Biol Chem. 280, 43087-99.
9. Schroder K., Hertzog P. J., Ravasi T., Hume D. A. (2004) Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions. J Leukoc Biol. 75, 163- 89.
10. Miller C. H., Maher S. G., Young H. A. (2009) Clinical Use of Interferon-gam ma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79.
11. Li, X., Leung, S., Burns, C., Stark, G.R. (1998) Cooperative binding of Stat1- 2 heterodimers and ISGF3 tandem DNA elements. Biochemie 80, 703-710.
12. Loppnow, H. (2001) Cytokines: classification, receptors, mechanisms of ac tion, Der Internist 42, 17-27.
13. Zakharova, N., Lymar, E.S.,Yang, E., Malik, S., Zhang, J.J., Roeder, R.G., Darnell, J.E. Jr., (2003) Distinct transcriptional activation functions of STAT1alpha and STAT1beta on DNA and chromatin templates. J Biol Chem. 278, 43067-73.
14. Liu, L., Okada, S., Kong, X.F. et al. (2011) Gain-of-function human STAT1 mutations impair IL-17 immunity and underlie chronic mucocutaneous candi diasis. J Exp Med. 208, 1635-48.
15. Shuai, K., Horvath, C. M., Huang, L. H., Qureshi, S.A., Cowburn, D., Darnell, J.E. Jr. (1994) Interferon activation of the transcription factor Stat91 involves dimerization through SH2-phosphotyrosyl peptide interactions. Cell 76, 821- 828.
16. Pestka S., Krause C. D., Walter M. R. (2004) Interferons, interferon-like cyto kines, and their receptors. Immunol Rev. 202, 8-32.
17. Shuai, K. (2000) Modulation of STAT signaling by STAT-interacting proteins. Oncogene 19, 2638-2644.
18. McBride, K.M., McDonalds, C. und Reich, N.C. (2000) Nuclear export signal located within the DNA-binding domain of the STAT1 transcription factor.
19. Reich, N.C. (2007) STAT dynamics. Cytokine & Growth Factor Rev. 18, 511– 518.
20. Yu, H., Pardoll, D., Jove, R. (2009) STATs in cancer inflammation and immu nity: a leading role for STAT3. Nat Rev Cancer. 9, 798-809.
21. Rebouillat, D., Hovanessian, A.G. (1999) The human 2',5'-oligoadenylate synthetase family: interferon-induced proteins with unique enzymatic proper ties. J Interferon Cytokine Res. 19, 295-308.
22. Zhang, T., Kee, W. H., Seow, K. T., Fung, W. and Cao, X. (2000) The coiled- coil domain of Stat3 is essential for its SH2 domain-mediated receptor bin ding and subsequent activation induced by epidermal growth factor and inter leukin-6. Mol. Cell Biol. 20, 7132-7139.
23. Lee, C.K., Rao, D.T., Gertner, R., Gimeno, R., Frey, A.B., Levy, D.E. (2000) Distinct requirements for IFNs and STAT1 in NK cell function. J Immunol 165, 3571-3577.
24. Strehlow, I., Schindler, C. (1998) Amino-terminal signal transducer and acti vator of transcription (STAT) domains regulate nuclear translocation and STAT deactivation. J Biol Chem 273, 28049-28056.
25. Melén K., Kinnunen, L., Julkunen, I. (2001) Arginine/Lysine-rich structural element is involved in Interferon-induced nuclear import of STATs. J Biol Chem 276, 16447-6455.
26. Meyer, T., Hendry, L., Begitt, A., John, S. and Vinkemeier, U. (2004) A single residue modulatestyrosine dephosphorylation, oligomerization, and nuclear accumulation of stat transcription factors. J. Biol. Chem. 279, 18998-19007.
27. Shen, Y., Darnell, J.E.Jr. (2001) Antiviral response in cells containing Stat1 with heterologous transactivation domains. J Virol. 75, 2627-33.
28. Lillemeier, B.F., Köster, M., Kerr, I.M. (2001) STAT1 from the cell membrane to the DNA. EMBO 20(10), 2508-17.
29. (1998) How cells respond to interferons. Annu. Rev. Biochem., 67, 227-264.
30. Marg, A., Shan, Y., Meyer, T., Meissner, T., Brandenburg, M., Vinkemeier, U. (2004) Nucleocytoplasmic shuttling by nucleoporins Nup153 and Nup214 and CRM1-dependent nuclear export control the subcellular distribution of latent Stat1. J Cell Biol 165, 823-833.
31. Inhibition of Stat1-mediated gene activation by PIAS1. Proc Natl Acad Sci USA 95, 10626-10631.
32. Samuel C. E. (2001) Antiviral actions of interferons. Clin Microbiol Rev. 14, 778-809.
33. Shuai, K., Stark,G.R., Kerr,I.M., Darnell, J.E. Jr. (1993) A single phosphotyro sine residue of Stat91 required for gene activation by interferon-γ. Science, 261, 1744-1746.

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