Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg

Titel:Aldehyd-oxidierende Enzyme im anaeroben Phenylalanin-Stoffwechsel von Aromatoleum aromaticum
Autor:Debnar-Daumler, Lisa Lena Carlotta
Weitere Beteiligte: Heider, Johann (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2014
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2014/0411
DOI: https://doi.org/10.17192/z2014.0411
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2014-04117
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel (trans.):Aldehyde-oxidizing enzymes in the anaerobic phenylalanine metabolism of Aromatoleum aromaticum
Publikationsdatum:2014-10-29
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
phenylalanine, Phenylacetaldehyd, Aldehyde, Aromatoleum, Dehydrogenase, Molybdän, tungsten, anaerobe, Moco, anaerob, Phenylalanin, Wolfram, aldehyde, Aromatoleum

Zusammenfassung:
Der anaerobe Abbau von Phenylalanin führt über das Zwischenprodukt Phenylacetat zu Benzoyl-CoA, dem häufigsten Intermediat im anaeroben Abbau von aromatischen Verbindungen. Das Zwischenprodukt Phenylacetat entsteht durch die Oxidation von Phenylacetaldehyd. Vor Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass Aromatoleum aromaticum sowohl eine Aldehyd:Ferredoxin-Oxidoreduktase (AOR) besitzt, die den Schritt katalysieren könnte, als auch ein oder mehrere Enzyme, die diese Oxidation mit NAD und NADP als Elektronenakzeptoren durchführen könnten. Folglich stellte sich die Frage, welches dieser Enzyme das Schlüsselenzym für den anaeroben Phenylalanin-Stoffwechsel darstellt. Außerdem ist die Entdeckung einer AOR in einem fakultativ anaeroben Bakterium ungewöhnlich, da AORs bisher ausschließlich aus obligat anaeroben, häufig hyperthermophilen Prokaryonten bekannt sind. A. aromaticum braucht ein Molybdän-Enzym zum denitrifizierenden Wachstum, nämlich die Nitrat-Reduktase. Alle bisher beschriebenen AORs enthalten das dem Molybdän sehr ähnliche Metall Wolfram. Vor diesem Hintergrund sollte untersucht werden, welches Metall die AOR aus A. aromaticum enthält. Für beide Fragestellungen war es wichtig, die Phenylacetaldehyd-oxidierenden Enzyme aus A. aromaticum-Zellen anzureichern und im Idealfall aufzureinigen. Durch vielfältige chromatographische Verfahren gelang es, alle Enzymaktivitäten in einem für die Bearbeitung der Fragestellungen ausreichenden Maße anzureichern. Metallanalysen der angereicherten AOR-Fraktionen und begleitende Wachstumsversuche mit verschiedenen Molybdat- und Wolframat-Konzentrationen zeigten, dass die AOR tatsächlich einen Wolfram-Cofaktor enthält und dieser nicht wirksam durch einen Molybdän-Cofaktor ersetzt werden kann. Folglich muss A. aromaticum zur selben Zeit spezifisch mindestens ein Mo- (Nitrat-Reduktase) und ein W-Enzym (AOR) herstellen können. Während die meisten Enzyme aus dem Molybdän-Cofaktor-Biosyntheseweg auch zur Biosynthese des Wolfram-Cofaktors dienen können, wurden in dieser Arbeit durch bioinformatische Analysen mehrere Enzyme gefunden, die eine Metall-Spezifität unterstützen könnten. Dazu gehören Molybdat- und Wolframat-spezifische Transporter und Enzyme, die das Metall auf den Cofaktor übertragen. Außerdem wurden Proteine aus dem Cofaktor-Biosyntheseweg gefunden, die in enger Assoziation mit AORs codiert werden und möglicherweise auch bei der Bereitstellung des richtigen Cofaktors eine Rolle spielen. Durch Anreicherung der NAD(P)-abhängigen Phenylacetaldehyd-oxidierenden Aktivitäten konnte das zugehörige Enzym, eine Aldehyd-Dehydrogenase, die durch das Gen ebA4954 codiert wird, identifiziert werden. Die Phenylacetaldehyd-Dehydrogenase (PDH) wurde heterolog produziert, mithilfe eines C-terminalen Strep-Tags aufgereinigt und biochemisch charakterisiert. Es handelt sich um ein Homotetramer, das sehr spezifisch für Phenylacetaldehyd ist, eine kooperative Kinetik zu diesem Substrat zeigt, stark durch steigende Phenylacetaldehyd-Konzentrationen inhibiert wird und sowohl NAD als auch NADP reduzieren kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit führen zu der neuen Hypothese, dass die PDH das Schlüsselenzym für den Phenylalanin-Stoffwechsel ist. Es wurde gezeigt, dass die AOR nicht essentiell für das denitrifizierende Wachstum auf Phenylalanin ist, aber verschiedenste Aldehyde mit ähnlichen Reaktionsgeschwindigkeiten oxidieren kann. Deshalb ist es vorstellbar, dass der AOR eine Funktion zur Detoxifizierung reaktiver Aldehyde zukommt, wenn der Stoffwechsel aus dem Gleichgewicht gerät. Die Erkenntnis, dass A. aromaticum gleichzeitig Molybdän- und Wolfram-Enzyme produzieren kann, eröffnet viele neue Fragestellungen und Forschungsansätze.

Bibliographie / References

  1. Laemmli UK (1970) Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227: 680-685
  2. Kisker C, Schindelin H, Rees DC (1997) Molybdenum-cofactor-containing enzymes: Structure and mechanism. Annu Rev Biochem 66: 233-267
  3. Heider J, Fuchs G (1997) Anaerobic metabolism of aromatic compounds. Eur J Biochem 243: 577- 596
  4. Niederreither K, Vermot J, Messaddeq N, Schuhbaur B, Chambon P, Dollé P (2001) Embryonic retinoic acid synthesis is essential for heart morphogenesis in the mouse. Development 128: 1019- 1050
  5. Gallagher SR (2001) One-dimensional electrophoresis using nondenaturing conditions. Curr Protoc Mol Biol Chapter 10: Unit 10.12B
  6. Mukund S, Adams MWW (1991) The Novel Tungsten-Iron-Sulfur Protein of the Hyperthermophilic Archaebacterium, Pyrococcus furiosus, Is an Aldehyde Ferredoxin Oxidoreductase -Evidence for its Participation in a Unique Glycolytic Pathway. J Biol Chem 266: 14208-14216
  7. Mendel RR, Kruse T (2012) Cell biology of molybdenum in plants and humans. Biochim Biophys Acta 1823: 1568-1579
  8. Wang M-F, Han C-L, Yin S-J (2009) Substrate specificity of human and yeast aldehyde dehydrogenases. Chem Biol Interact 178: 36-39
  9. Magalon A, Fedor JG, Walburger A, Weiner JH (2011) Molybdenum enzymes in bacteria and their maturation. Coordin Chem Rev 255
  10. Hagen WR (2011) Cellular uptake of molybdenum and tungsten. Coord Chem Rev 255: 1117-1128
  11. Hales B, Case E, Morningstar J, Dzeda M, Mauterer L (1986) Isolation of a new vanadium- containing nitrogenase from Azotobacter vinelandii. Biochemistry 25: 7251-7255
  12. Hollenstein K, Frei DC, Locher KP (2007) Structure of an ABC transporter in complex with its binding protein. Nature 446: 213-216
  13. Fuchs G, Boll M, Heider J (2011) Microbial degradation of aromatic compounds — from one strategy to four. Nat Rev Micro 9: 803-816
  14. Hirsch W, Schägger H, Fuchs G (1998) Phenylglyoxylate:NAD oxidoreductase (CoA benzoylating), a new enzyme of anaerobic phenylalanine metabolism in the denitrifying bacterium Azoarcus evansii. Eur J Biochem 251: 907-915
  15. Mukund S, Adams MWW (1995) Glyceraldehyde-3-phosphate Ferredoxin Oxidoreductase, a Novel Tungsten-containing Enzyme with a Potential Glycolytic Role in the Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus. J Biol Chem 270: 8389-8392
  16. Makdessi K, Andreesen JR, Pich A (2001) Tungstate Uptake by a Highly Specific ABC Transporter in Eubacterium acidaminophilum. J Biol Chem 276: 24557-24564
  17. Kuwayama H, Obara S, Morio T, Katoh M, Urushihara H, Tanaka Y (2002) PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res 30: e2
  18. Murray MG, Thompson WF (1980) Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8: 4321-4325
  19. Pfennig N (1978) Rhodocyclus purpureus gen. nov. and sp. nov., a ring-shaped, vitamin B12- requiring member of the family Rhodospirillaceae. Int J Syst Bacteriol 28: 283-288
  20. Kalyuzhnaya MG, De Marco P, Bowerman S, Pacheco CC, Lara JC, Lidstrom ME, Chistoserdova L (2006) Methyloversatilis universalis gen. nov., sp. nov., a novel taxon within the Betaproteobacteria represented by three methylotrophic isolates. Int J Syst Evol Microbiol 56: 2517-2522
  21. Wöhlbrand L, Kallerhoff B, Lange D, Hufnagel P, Thiermann J, Reinhardt R, Rabus R (2007) Functional proteomic view of metabolic regulation in "Aromatoleum aromaticum" strain EbN1. Proteomics 7: 2222-2239
  22. Maratea D, Blakemore RP (1981) Aquaspirillum magnetotacticum sp. nov., a Magnetic Spirillum.
  23. Mohamed MES, Seyfried B, Tschech A, Fuchs G (1993) Anaerobic oxidation of phenylacetate and 4-hydroxyphenylacetate to benzoyl-coenzyme A and CO 2 in denitrifying Pseudomonas sp. - Evidence for an alpha-oxidation mechanism. Arch Microbiol 159: 563-573
  24. Schneider S, Mohamed MES, Fuchs G (1997) Anaerobic metabolism of L-phenylalanine via benzoyl-CoA in the denitrifying bacterium Thauera aromatica. Arch Microbiol 168: 310-320
  25. Ehrlich F (1907) Concerning the conditions for fusel oil formation and concerning its connection with the protein formation of yeast. Berichte Der Deutschen Chemischen Gesellschaft 40: 1027- 1047
  26. Wöhlbrand L, Rabus R (2009) Development of a Genetic System for the Denitrifying Bacterium 'Aromatoleum aromaticum' Strain EbN1. J Mol Microbiol Biotechnol 17: 41-52
  27. Kovach ME, Elzer PH, Hill DS, Robertson GT, Farris MA, Roop RM, Peterson KM (1995) Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic- resistance cassettes. Gene 166: 175-176
  28. Raaijmakers H, Macieira S, Dias JM, Teixeira S, Bursakov S, Huber R, Moura JJG, Moura I, Romão MJ (2002) Gene Sequence and the 1.8 Å Crystal Structure of the Tungsten-Containing Formate Dehydrogenase from Desulfovibrio gigas. Structure 10: 1261-1272
  29. Inoue H, Nojima H, Okayama H (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96: 23-28
  30. MoFe-protein at 1.16 A resolution: a central ligand in the FeMo-cofactor. Science 297: 1696-1700
  31. Ferrández A, Prieto MA, García JL, Díaz E (1997) Molecular characterization of PadA, a phenylacetaldehyde dehydrogenase from Escherichia coli. FEBS Lett 406: 23-27
  32. Hoagland D (1945) Molybdenum in relation to plant growth. Soil Sci 60: 119
  33. Horner CK, Burk D (1942) Nitrogen fixation by Azotobacter as influenced by molybdenum and vanadium. J Agr Research 65: 0173-0193
  34. Schweiger P, Volland S, Deppenmeier U (2007) Overproduction and characterization of two distinct aldehyde-oxidizing enzymes from Gluconobacter oxydans 621H. J Mol Microbiol Biotechnol 13: 147-155
  35. Wilson K (2001) Preparation of genomic DNA from bacteria. Current protocols in molecular biology / edited by Frederick M Ausubel [et al] Chapter 2
  36. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA (1988) Primer- directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487- 491
  37. Green AA, Hughes WL (1955) Protein fractionation on the basis of solubility in aqueous solutions of salts and organic solvents. In Methods in Enzymology, Colowick SP, Kaplan NO (eds), Vol. 1, 10, pp 67-90. New York: Academic Press Grunden AM, Ray RM, Rosentel JK, Healy FG, Shanmugam KT (1996) Repression of the Escherichia coli modABCD (Molybdate Transport) Operon by ModE. J Bacteriol 178: 735-744
  38. Hagedoorn PL, Chen TH, Schröder I, Piersma SR, de Vries S, Hagen WR (2005) Purification and characterization of the tungsten enzyme aldehyde:ferredoxin oxidoreductase from the hyperthermophilic denitrifier Pyrobaculum aerophilum. J Biol Inorg Chem 10: 259-269
  39. Schäfer A, Tauch A, Jäger W, Kalinowski J, Thierbach G, Pühler A (1994) Small mobilizable multi- purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene 145: 69-73
  40. Stiefel EL (2002) The biogeochemistry of molybdenum and tungsten. Molybdenum and Tungsten: Their Roles in Biological Processes 39: 1-29
  41. Kessler D, Herth W, Knappe J (1992) Ultrastructure and pyruvate formate-lyase radical quenching property of the multienzymic AdhE protein of Escherichia coli. J Biol Chem 267: 18073-18079
  42. Smart JP, Cliff MJ, Kelly DJ (2009) A role for tungsten in the biology of Campylobacter jejuni: tungstate stimulates formate dehydrogenase activity and is transported via an ultra-high affinity ABC system distinct from the molybdate transporter. Mol Microbiol 74: 742-757
  43. Trautwein T, Krauss F, Lottspeich F, Simon H (1994) The (2R)-hydroxycarboxylate-viologen- oxidoreductase from Proteus vulgaris is a molybdenum-containing iron-sulphur protein. Eur J Biochem 222: 1025-1032
  44. Tarvin D, Buswell AM (1934) The methane fermentation of organic acids and carbohydrates. J Am Chem Soc 56: 1751-1755
  45. Mendel RR (2005) Molybdenum: biological activity and metabolism. Dalton Trans: 3404-3409
  46. Schwarz G, Mendel RR, Ribbe MW (2009) Molybdenum cofactors, enzymes and pathways. Nature 460: 839-847
  47. Debnar-Daumler C, Seubert A, Schmitt G, Heider J (2014) Simultaneous Involvement of a Tungsten-Containing Aldehyde:Ferredoxin Oxidoreductase and a Phenylacetaldehyde Dehydrogenase in Anaerobic Phenylalanine Metabolism. J Bacteriol 196: 483-492
  48. Vivian JT, Callis PR (2001) Mechanisms of Tryptophan Fluorescence Shifts in Proteins. Biophys J 80: 2093-2109
  49. Heider J, Ma K, Adams MWW (1995) Purification, characterization, and metabolic function of tungsten-containing aldehyde ferredoxin oxidoreductase from the hyperthermophilic and proteolytic archaeon Thermococcus strain ES-1. J Bacteriol 177: 4757-4764
  50. Nichols JD, Xiang S, Schindelin H, Rajagopalan KV (2007) Mutational analysis of Escherichia coli MoeA: Two functional activities map to the active site cleft. Biochemistry 46: 78-86
  51. Schmidt TM, Arieli B, Cohen Y, Padan E, Strohl WR (1987) Sulfur metabolism in Beggiatoa alba. J Bacteriol 169: 5466-5472
  52. Gay P, Le Coq D, Steinmetz M, Berkelman T, Kado CI (1985) Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol 164: 918-921
  53. Sevcenco A-M, Bevers LE, Pinkse MWH, Krijger GC, Wolterbeek HT, Verhaert PDEM, Hagen WR, Hagedoorn P-L (2010) Molybdenum Incorporation in Tungsten Aldehyde Oxidoreductase Enzymes from Pyrococcus furiosus. Journal of Bacteriology 192: 4143-4152
  54. Teufel R, Mascaraque V, Ismail W, Voss M, Perera J, Eisenreich W, Haehnel W, Fuchs G (2010) Bacterial phenylalanine and phenylacetate catabolic pathway revealed. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 14390-14395
  55. Leimkühler S, Wuebbens MM, Rajagopalan KV (2011) The History of the Discovery of the Molybdenum Cofactor and Novel Aspects of its Biosynthesis in Bacteria. Coord Chem Rev 255: 1129-1144
  56. Mota CS, Valette O, González PJ, Brondino CD, Moura JJG, Moura I, Dolla A, Rivas MG (2011) Effects of molybdate and tungstate on expression levels and biochemical characteristics of formate dehydrogenases produced by Desulfovibrio alaskensis NCIMB 13491. J Bacteriol 193: 2917-2923
  57. Weretilnyk EA, Hanson AD (1990) Molecular cloning of a plant betaine-aldehyde dehydrogenase, an enzyme implicated in adaptation to salinity and drought. Proc Natl Acad Sci U S A 87: 2745- 2754
  58. Roy R, Mukund S, Schut GJ, Dunn DM, Weiss R, Adams MWW (1999) Purification and Molecular Characterization of the Tungsten-Containing Formaldehyde Ferredoxin Oxidoreductase from the Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus: the Third of a Putative Five-Member Tungstoenzyme Family. J Bacteriol 181: 1171-1180
  59. Leimkühler S, Klipp W (1999) Role of XDHC in Molybdenum Cofactor Insertion into Xanthine Dehydrogenase of Rhodobacter capsulatus. J Bacteriol 181: 2745-2751
  60. Wang H, Tseng C-P, Gunsalus RP (1999) The napF and narG nitrate reductase operons in Escherichia coli are differentially expressed in response to submicromolar concentrations of nitrate but not nitrite. J Bacteriol 181: 5303-5308
  61. Schrödinger, LLC. (2010) The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.3.
  62. Imperial J, Hadi M, Amy NK (1998) Molybdate binding by ModA, the periplasmic component of the Escherichia coli mod molybdate transport system. Biochim Biophys Acta 1370: 337-346
  63. Self WT, Grunden AM, Hasona A, Shanmugam KT (2001) Molybdate transport. Res Microbiol 152: 311-321
  64. Hille R (2002) Molybdenum and tungsten in biology. Trends Biochem Sci 27: 360-367
  65. O'Brien PJ, Siraki AG, Shangari N (2005) Aldehyde Sources, Metabolism, Molecular Toxicity Mechanisms, and Possible Effects on Human Health. Crit Rev Toxicol 35


* Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten