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Titel:Neue Gentargeting-Strategien auf Basis der RNA interference RNAi
Autor:Werth, Stephanie
Weitere Beteiligte: Aigner, Achim (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2013
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2013/0456
DOI: https://doi.org/10.17192/z2013.0456
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2013-04563
DDC:570 Biowissenschaften, Biologie
Titel (trans.):New gene targeting strategies based on RNAi
Publikationsdatum:2013-08-21
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
PEI, Vascular endothelial Growth Factor, PTN, Polyethylenimin, PTN, RNAi, RNAi, RNS-Interferenz, PEI

Zusammenfassung:
RNA Interferenz ist ein natürlicher Prozess in eukaryoten Zellen, der zur spezifischen Herunterregulation der Genexpression (Gen-Silencing) führt. Der Mechanismus der RNAi wird durch 21 - 23 nt lange doppelsträngige RNA-Moleküle (siRNA) vermittelt, welche sequenzspezifisch den Abbau und die Degradation ihrer Ziel-mRNA herbeiführen, indem sie den RISC-Komplex im Zytosol zu seiner Ziel-mRNA dirigieren. Ein Kriterium bei der Transfektion der Zellen mit siRNA ist der schnelle Abbau der Nukleinsäuren durch Ribonukleasen und damit eine verminderte Transfektionseffizienz. Polyethylenimine sind synthetische Polymere, die in verschiedenen Molmassen vorliegen und die eine hohe kationische Ladungsdichte aufweisen. Aufgrund dieser Protonierung sind sie in der Lage, Komplexe mit siRNA oder DNA zu bilden. Als positiv geladene Polyplexe interagieren sie dann mit der Zellmembran und werden per Endozytose in das Zytosol aufgenommen. Die Pufferkapazität der Polyethylenimine ermöglicht das Verlassen der Lyosomen nach deren Platzen (Protonenschwammhypothese) und schützt die Nukleinsäuren vor der Degradation. In dieser Arbeit wurde die gelpermeationschromatographische Trennung der Lösung eines verzweigten 25-kDa-Polyethylenimins zur Herstellung eines Low molecular weight Polyethylenimins genutzt. Dieses als F25-LMW-PEI bezeichnete Polyethylenimin zeigte eine verbesserte Transfektionseffizienz sowie eine geringere Zytotoxizität, die bei Transfektionsversuchen mit den Zelllinien SKOV3, U87 und PC3 näher untersucht wurden. Hier konnten bei Co-Transfektionen mit DNA hervorragende Transfektionseigenschaften nachgewiesen werden. Gleichfalls war die durch siRNA vermittelte Herunterregulation der Luciferase bei stabil Luciferase-exprimierenden SKOV3-10-Zellen unter verschiedenen Transfektionsbedingungen eindeutig nachweisbar. Auch nach Lyophilisierung und Resolubilisierung der PEI/siRNA/DNA-Komplexe konnte ein Genknockdown durch RNAi beobachtet werden. Zur weiteren Charakterisierung des F25-LMW-PEI-vermittelten siRNA-Targetings tumorrelevanter Genprodukte wurden die Prostatakarzinomzelllinie PC3 sowie die Glioblastomzelllinie U87 verwendet. Die Prostatakarzinomzellen PC3 exprimieren den wichtigen Angiogenese-Faktor VEGF, welcher vermehrt beim Tumorwachstum und der damit verbundenen Angiogenese nachgewiesen wird. Eine Vielzahl von Krebsarten geht mit einer erhöhten VEGF-mRNA-Expression einher. Die Möglichkeit des wirkungsvollen siRNA-Targetings und des Knockdowns wurde durch ein vermindertes PC3-Zellwachstum im WST-Assay dargestellt. U87-Zellen exprimieren den Heparin-bindenden Wachstumsfaktor Pleiotrophin (PTN), welcher vermehrt bei bösartigen Erkrankungen gefunden wird. Die protoonkogene Wirkung des PTN-Gens beruht hauptsächlich auf der Stimulation der Proliferation von Tumorzellen und der Angiogenese. Bei den U87-Zellen konnte bei den mit der spezifischen PTN-siRNA transfizierten Zellen eine PTN-Herunterregulation auf mRNA- und Protein-Ebene nachgewiesen werden, was zu einer verminderten Zellproliferation führte. Die Möglichkeit der Lyophilisierung der F25-LMW-PEI/siRNA-Komplexe war auch bei Transfektion der PC3- sowie der U87-Zellen eindeutig nachweisbar und es zeigten sich nach der Transfektion mit den spezifischen siRNAs ein vermindertes Zellwachstum der malignen Zellen sowie eine verminderte Konzentration von PTN auf Proteinebene.

Bibliographie / References

  1. Höbel, S., Aigner, A. " Polyethylenimine (PEI)/siRNA-mediated gene knockdown in vitro and in vivo " Methods Mol Biol. 2010;623:283-97.
  2. Senger, D. R. " Retrospetive: Vascular Endothelial Growth Factor: Much More than an Angiogenesis Factor " Molecular Biology of the Cell, Vol. 21, 377–379, February 1, 2010 [Singha et al. (2011)]
  3. Tol, J., Punt, C. J. " Monoclonal antibodies in the treatment of metastatic colorectal cancer: a review " Clin Ther. 2010 Mar;32(3):437-53 [Urban-Klein et al. (2005)]
  4. Jiang, H. L., Kim, T. H., Kim, Y. K., Park, I. Y., Cho, M. H., Cho, C. S. " Efficient gene delivery using chitosan-polyethylenimine hybrid systems " Biomed Mater. 2008 Jun;3(2):025013.
  5. Seisenberger, G., Ried, M. U., Endress, T., Buning, H., Hallek, M. and Brauchle, C. (2001) " Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus " Science 294(5548): 1929-32 [Schröder et al. (2009)]
  6. Roy, H., Bhardwaj, S., Ylä-Herttuala, S. " Biology of vascular endothelial growth factors " FEBS Letters 580 (2006) 2879-2887 [Seisenberger et al. (2001)]
  7. Kabanov, V. A., Kabanov A. V. " Interpolyelectrolyte and block ionomer complexes for gene delivery: physico-chemical aspects " Adv Drug Deliv Rev. 1998 Mar 2;30(1-3):49-60.
  8. Suh, J., Paik, H. J., Hwang, B. K. " Ionization of Poly(ethylenimine) and Poly(allylamine) at various pH′s " Bioorg. Chem. 22 (1994) 318-327 [Talsma et al. (1997)]
  9. Rols, M. P. " Mechanism by which electroporation mediates DNA migration and entry into cells and targeted tissues " Methods Mol Biol. 2008;423:19-33 [Roy et al. (2006)]
  10. of frozen complexes as fully active reagents in siRNA-mediated gene targeting and DNA delivery " Eur J Pharm Biopharm. 2008 Sep;70(1):29-41.
  11. Imai, S., Kaksonen, M., Raulo, E., Kinnunen, T., Fages, C., Meng, X., Lakso, M., Rauvala, H. " Osteoblast Recruitment and Bone Formation Enhanced by cell Matrixassociated Heparin-binding Growth-associated Molecule (HB-GAM). J Cell Biol. 143: 1113-1128 (1998) [Jäger et al. (2012)]
  12. Schulte, A., and Wellstein, A. (1997) " Pleiotrophin and related molecules " Bicknell, R., Lewis, C. M. and Ferrara, N. (eds.), Tumor angiogenesis, pp. 273-
  13. Singha, K., Namgung, R., Kim, W. J. " Polymers in Small-Interfering RNA Delivery " Nucleic Acid Ther. 2011 June; 21(3): 133–147 [Souttou et al. (1998)]
  14. Souttou, B., Juhl, H., Hackenbruck, J., Röckseisen, M., Klomp, H. J., Raulais, D., Vigny, M., Wellstein, A. " Relationship between serum concentrations of the growth factor pleiotrophin and pleiotrophin-positive tumors " J Natl Cancer Inst. 1998 Oct 7;90(19):1468-73.
  15. Robert, N. J., Diéras, V., Glaspy, J., Brufsky, A. M., Bondarenko, I., Lipatov, O. N., Perez, E. A., Yardley, D. A., Chan, S. Y., Zhou, X., Phan, S. C., O'Shaughnessy, J. " RIBBON-1: randomized, double-blind, placebo-controlled, phase III trial of chemotherapy with or without bevacizumab for first-line treatment of human epidermal growth factor receptor 2-negative, locally recurrent or metastatic breast cancer " J Clin Oncol. 2011 Apr 1;29(10):1252-60 [Rols (2008)]
  16. Urban-Klein, B., Werth, S., Czubayko, F., Aigner, A. (2005) " RNAi-mediated gene-targeting through systemic application of polyethylenimine (PEI)- complexed siRNA in vivo. " Gene Therapy 12(5): 461-466 [Vandoorne et al. (2010)]
  17. Schröder FH, Hugosson J, Roobol MJ et al. (2009) Screening and prostate- cancer mortality in a randomized European study. N Engl J Med. 2009 Mar 26; 360(13): 1320–8
  18. Talsma, H., Cherng, J., Lehrmann, H., Kursa, M., Ogris, M., Hennink, W. E., Cotten, M., Wagner, E. " Stabilization of gene delivery systems by freeze-drying " Int J Pharm. 1997 Nov 28;157(2):233-238 [Tang and Szoka (1997)]
  19. Tang, M. X., Szoka, F. C. " The influence of polymer structure on the interactions of cationic polymers with DNA and morphology of the resulting complexes " Gene Ther. 1997 Aug;4(8):823-32 [Tol et al. (2010)]
  20. Kajdaniuk, D., Marek, B., Forty, W., Kos-Kudła, B. " Vascular endothelial growth factor (VEGF) -part 1: in physiology and pathophysiology " Endokrynol Pol. 2011; 62(5):444-55.
  21. Beiträge zur Gesundheitsberichterstattung des Bundes " Verbreitung von Krebserkrankungen in Deutschland, Entwicklung der Prävalenzen zwischen 1990 und 2010 " Eine Veröffentlichung des Zentrums für Krebsregisterdaten am RKI, Robert Koch-Institut, Berlin 2010, Bibliografische Information Der Deutschen Bibliothek (Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie) [Robert et al. (2011)]
  22. Jäger, M., Schubert, S., Ochrimenko, S., Fischer, D., Schubert, U. S. " Branched and linear poly(ethylene imine)-based conjugates: synthetic modification, characterization, and application " Chem Soc Rev. 2012 Jul 7;41(13):4755-67 [Jiang et al. (2008)]
  23. Stoica, G. E., Kuo, A., Aigner, A., Sunitha, I., Souttou, B., Malerczyk, C., Caughey, D. J., Wen, D., Karavanov, A., Riegel, A. T., Wellstein, A. " Identification of anaplastic lymphoma kinase as a receptor for the growth factor pleiotrophin " J Biol Chem 2001, 276:16772-16779
  24. Ribatti, D., Vacca, A. " The role of microenvironment in tumor angiogenesis " Genes Nutr. 2008 Apr; 3(1):29-34
  25. Kamba T, McDonald DM. Mechanisms of adverse effects of anti-VEGF therapy for cancer. Br J Cancer. 2007 Jun 18;96(12):1788-95 [Kambhampati et al. (2005)]
  26. Remy, J. S., Abdallah, B., Zanta M. A., et al. " Gene transfer with lipospermines and polyethylenimines " Advanced Drug Delivery Reviews 30 (1998) 85-95 [Ribatti et al. (2008)]
  27. Honoré, I., Grosse, S., Frison, N., Favatier, F., Monsigny, M., Fajac, I. " Transcription of plasmid DNA: influence of plasmid DNA/polyethylenimine complex formation " J Control Release. 2005 Oct 20;107(3):537-46 [Imai et al. (1998)]
  28. Kambhampati, S., Ray, G., Sengupta, K., Reddy, V. P., Banerjee, S. K., Van Veldhuizen, P. J. " Growth factors involved in prostate carcinogenesis " Front Biosci. 2005 May 1;10:1355-67 [Remy et al. (1998)]


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