Dokument

Zusammenfassung:
Der Transkriptionsfaktor Sp2 gehört zur Familie der Sp/KLF Transkriptionsfaktoren. Diese Proteine besitzen eine charakteristische C-terminale DNA-Bindedomäne, die aus drei Zinkfingern vom Typ C2H2 besteht und die Bindung an spezifische DNA-Sequenzen, sogenannte GC- und GT-Boxen, vermittelt. Diese DNA-Elemente findet man in Promotoren zahlreicher Gene, wie z.B. Haushaltsgene oder Gene, die einer spezifischen Regulation unterliegen. Über den Transkriptionsfaktor Sp2 war zu Beginn dieser Arbeit wenig bekannt. Eine DNA-Bindung des volle-Länge Proteins in EMSAs konnte nicht nachgewiesen werden, ebenso wenig eine Funktion als transkriptioneller Aktivator. Es gab Hinweise, dass es eine Region im Sp2 Protein gibt, die die DNA Bindung inhibiert oder reguliert, möglicherweise durch die Interaktion mit anderen Proteinen. Die Herstellung einer transgenen Sp2 knock-out Mauslinie zur Untersuchung der Funktion von Sp2 in vivo war bereits erfolgt, und es war bekannt, dass Mäuse Sp2-defiziente Mäuse in einem frühen Embryonalstadium sterben. Die Ziele dieser Arbeit bestanden darin, (I) die DNA-Bindungseigenschaften von Sp2 näher zu untersuchen, (II) zu testen, ob Sp2 mit anderen Proteinen interagiert und diese gegebenenfalls zu identifizieren und (III) die Analyse der Funktion von Sp2 in vivo durch die Etablierung von Sp2 knock-out MEFs sowie einer konditionellen Sp2 knock-out Linie zu ermöglichen. Um die DNA-Bindungseigenschaften von Sp2 im EMSA zu analysieren, wurde neben dem volle-Länge Sp2 Protein eine Reihe von Deletionsmutanten verwendet. Diese Analysen ergaben, dass volle-Länge Sp2 unter keiner der getesteten Bedingungen im EMSA DNA bindet. Zudem wurde gezeigt, dass es im Sp2 Protein mindestens drei Regionen gibt, die die DNA-Bindung inhibieren, wobei der zugrundeliegende Mechanismus nicht aufgeklärt werden konnte. Möglicherweise vermitteln diese Regionen die Interaktion mit anderen Proteinen, die dann die DNA-Bindung von Sp2 inhibieren. Größenfraktionierungen mittels Gelchromatographie zeigten, dass Sp2 in mehreren hochmolekularen Fraktionen zu finden ist. Dieser Befund ist ein Indiz dafür, dass Sp2 mit anderen Proteinen interagiert. Um diese Interaktionspartner zu identifizieren, wurde ein Hefe-zwei-Hybrid Screen durchgeführt. Zwei Proteine, RNF197 und RACK1, wurden als Interaktionspartner von Sp2 identifiziert. Jedoch konnten diese Interaktionen nicht durch Co-Immunpräzipitationen validiert werden. Um Interaktionspartner von Sp2 mit einer anderen Methode zu identifizieren, wurden unter Verwendung von Sp2-3xFlag Co-Immunpräzipitationen mit anschließender massenspektrometrischer Analyse durchgeführt. Dabei wurden insgesamt 279 potentielle Interaktionspartner gefunden. Zwei von ihnen, E2F6 und PBBP4, wurden ausgewählt, um ihre Interaktion mit Sp2 mittels Co-Immunpräzipitation zu validieren. Jedoch konnten diese Interaktionen weder bestätigt noch ausgeschlossen werden. Um die Funktion von Sp2 in vivo untersuchen zu können, sollten Sp2-defiziente MEFs hergestellt werden. Sp2 knock-out MEFs wurden aus E9,5 Embryonen isoliert, allerdings proliferierten diese in Kultur nicht weiter. Um dennoch die Funktion von Sp2 in vivo untersuchen zu können, wurde eine Mauslinie hergestellt, die es ermöglicht, Sp2 konditionell zu depletieren. Aus E13,5 Embryonen wurden MEF Kulturen etabliert, die im Rahmen von zwei Diplomarbeiten für weiterführende Experimente verwendet wurden. Dabei wurde gezeigt, dass die Depletion von Sp2 durch die Infektion mit einem Retrovirus, der für Cre-Rekombinase kodiert, die Proliferation dieser Zellen inhibiert. Sp2 ist also sowohl für die normale Entwicklung von Mausembryonen als auch für die Proliferation von Zellen in Kultur essentiell.

Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten