Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg

Titel:Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Biosynthese von Mykotoxinen aus Ascomyceten
Autor:Matuschek, Marco
Weitere Beteiligte: Li, Shu-Ming (Prof. Dr. )
Veröffentlicht:2012
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2012/0508
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2012-05084
DOI: https://doi.org/10.17192/z2012.0508
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Molecular biological and biochemical investigations of the biosynthesis of mycotoxins in ascomycota
Publikationsdatum:2012-07-11
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Ergotalkaloide, Gencluster, Penicillium commune, Aspergillus fumigatus, Mutterkornpilz, Sekundärmetabolite, Schlauchpilze, Penicillium commune, Penicillium, Secondary metabolites

Zusammenfassung:
Die Sekundärmetabolit-Produktion der Pilze stellt eine wichtige Quelle von biologisch aktiven Stoffen dar. Innerhalb der Sekundärmetabolite besitzen die Ergotalkaloide sowohl pharmazeutisch-nützliche als auch toxische Eigenschaften. Die Ergotalkaloide gehören zu den Indolalkaloiden. Momentan ist Claviceps purpurea (C. purpurea) einer der wichtigsten Stämme für die industrielle Ergotalkaloidproduktion. C. purpurea produziert hauptsächlich die Ergotalkaloide Ergotamin, Ergocryptin und verwandte Ergopeptine. Im Gegensatz dazu wurden aus Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) und Penicillium commune (P. commune) die Clavinalkaloide, darunter Festuclavin, Pyroclavin und die Fumigaclavine A, B und C, isoliert. Ein gemeinsames strukturelles Merkmal dieser Substanzen ist das tetrazyklische Ergolinringsystem. Im Verlauf der Ergotalkaloidbiosynthese stellt Chanoclavin-I-Aldehyd einen Verzweigungspunkt dar. In C. purpurea wird Ergotamin und in A. fumigatus bzw. P. commune Fumigaclavin C bzw. A gebildet. Das Ergotamin enthält einen Tripeptidrest, während die Fumigaclavine andere Substituenten enthalten, z.B. eine Acetoxy-Gruppe an C-9. Zusätzlich unterscheiden sich Fumigaclavin C aus A. fumigatus bzw. Fumigaclavin A aus P. commune stereochemisch an der Position C-8 des Ergolinrings. In dieser Arbeit wurde das Vorkommen von Ergotalkaloidgenclustern innerhalb der Ascomyceten untersucht. Dabei wurden aus 53 verschiedenen Pilzfamilien 138 in der NCBI-Datenbank verfügbare Pilzgenome auf Sequenzhomologien zu den sieben orthologen Genen von A. fumigatus und C. purpurea analysiert. Es wurden insgesamt 23 Pilze identifiziert, die putative Ergotalkaloidgencluster enthielten. Diese 23 Pilze verteilen sich innerhalb der Ascomyceten auf die drei Familien Clavicipitaceae, Trichocomaceae und Arthrodermataceae. Zum funktionellen Nachweis wurde das Gen fgaOx1 aus A. fumigatus und sein Homolog easE aus C. purpurea untersucht. Beide Gene wurden in Expressionsvektoren kloniert und Expressionsbedingungen in Escherichia coli (E. coli) bzw. in Saccharomyces cerevisiae getestet. Leider blieben die Expressionsversuche der beiden Gene erfolglos. Weitere Proteinsequenzanalysen von FgaOx1 ergaben, dass wahrscheinlich zwei Membrandomänen vorhanden sind. Im Falle des Gens easE ergaben sich während der Untersuchungen der Pilzgenome der Ascomyceten neue Ergebnisse. Wahrscheinlich ist die Intron-Exon-Struktur innerhalb der NCBI-Datenbank fehlerhaft. Die Verzweigungspunkte der Ergotalkaloidbiosynthesen in C. purpurea, A. fumigatus und P. commune wurde durch diese Arbeit weiter aufgeklärt. Durch die Expression der Gene easA und easG aus C. purpurea und deren Aufreinigung sowie der biochemischen Charakterisierung der kodierten Proteine konnte gezeigt werden, dass Chanoclavin-I-Aldehyd in Gegenwart von reduziertem Glutathion durch EasG allein zu Agroclavin umgesetzt wird. Für diesen Schritt war keine Beteiligung von EasA nötig, vielmehr scheint das Protein EasA seine Funktion evolutionär verloren zu haben. In dem postulierten Reaktionsmechanismus von Chanoclavin-I-Aldehyd zu Agroclavin werden ein Isomerisierungs- und ein Reduktionsschritt benötigt. Es konnte gezeigt werden, dass die Isomerisierung durch ein nicht-enzymatisches Intermediat von Chanoclavin-I-Aldehyd mit Glutathion (GSH) vollzogen wird. Die Reduktion hingegen erfolgt enzymatisch durch das Protein EasG, das als Iminreduktase fungiert. Für die Katalyse benötigt EasG den Kofaktor NADPH. Die Struktur des Agroclavins wurde eindeutig durch NMR- und MS-Analysen identifiziert. Durch die Kombination von FgaOx3 aus A. fumigatus mit EasG aus C. purpurea konnte gezeigt werden, dass beide Proteine zusammen die Reaktion von Chanoclavin-I-Aldehyd zu Festuclavin und seinem Stereoisomer Pyroclavin katalysieren. Zuvor war nur bekannt, dass FgaOx3 und FgaFS aus A. fumigatus zusammen Festuclavin bilden. Im Zusammenhang mit diesen Ergebnissen erfolgte die Amplifikation und anschließende Expression der orthologen Gene fgaOx3pc und fgaFSpc aus P. commune NRRL2033 und die Aufreinigung beider Proteine. Die Kombination aller Orthologen lieferte neue Erkenntnisse über den Reaktionsmechanismus und damit auch über den Verzweigungspunkt der Ergotalkaloidbiosynthese in A. fumigatus und P. commune. Im Unterschied zum Reaktionsmechanismus in C. purpurea werden in A. fumigatus und P. commune zwei Reduktionsschritte für die Umsetzung von Chanoclavin-I-Aldehyd zu Festuclavin und Pyroclavin benötigt. Dabei katalysieren FgaOx3 bzw. FgaOx3pc den ersten und die Iminreduktasen FgaFS bzw. FgaFSpc den zweiten Reduktionsschritt. Im Gegensatz zu früher veröffentlichten Hypothesen einer anderen Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die Iminreduktasen FgaFS bzw. FgaFSpc die Stereochemie der Gesamtreaktion festlegen und nicht die auch als old yellow enzymes bekannten Reduktasen FgaOx3 bzw. FgaOx3pc. Zudem wird durch die jeweilige Iminreduktase das Produktverhältnis zwischen Festuclavin und Pyroclavin festgelegt.

Summary:
Fungi are rich sources of secondary metabolites. Among these secondary metabolites, the ergot alkaloids are both pharmaceutically useful and toxic. Ergot alkaloids are indole derivatives produced by fungi of the genera Claviceps, Aspergillus and Penicillium with Claviceps purpurea (C. purpurea) as the most important producer for medical use. C. purpurea produces ergotamine and ergocryptine as main ergot alkaloids. The clavine-type alkaloids, e.g. festuclavine, pyroclavine and fumigaclavines A, B and C are mainly produced by the fungi Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) and Penicillium commune (P. commune). Chanoclavine-I-aldehyde is a branch point of ergot alkaloid biosynthesis for ergotamine in C. purpurea and fumigaclavines C and A, respectively in A. fumigatus and P. commune. Ergotamine is characterized by a peptide moiety which is absent in the fumigaclavines. Instead, the fumigaclavines contain additional substituents, e.g. alcohol or acetoxy group at C-9 and a reverse prenyl moiety at C-2. Furthermore, the C-8 stereochemistry of fumigaclavine C from A. fumigatus and fumigaclavine A from P. commune differs. In this study, the presence of genes for ergot alkaloid biosynthesis in ascomycetous fungi was investigated. For this purpose, 138 available genomes of 53 fungi families of the NCBI database were screened with the sequences of the seven orthologous genes from C. purpurea and A. fumigatus. 23 ascomycetous fungi belonging to the families Trichocomaceae, Clavicipitaceae and Arthrodermataceae were identified to contain putative ergot alkaloid gene clusters. The family Clavicipitaceae is assigned to the class of Sordariomycetes, whereas the families Trichocomaceae and Arthrodermataceae are members of the class of Eurotiomycetes. The two identified fungi of the genus Metarhizium belong to the family Clavicipitaceae. Until now, no ergot alkaloids have been isolated from fungi neither of the genus Metarhizium nor of fungi of the family Arthrodermataceae. To prove functions, the gene fgaOx1 from A. fumigatus and its orthologue easE from C. purpurea were cloned into expression vectors for Escherichia coli (E. coli). In case of fgaOx1 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) was also tested as expression strain. Unfortunately, no overexpression was detectable under different conditions. Additional protein sequence analysis indicated that FgaOx1 contains two membrane domains. Furthermore, analysis of genes of ergot alkaloid biosynthesis in ascomycetous fungi revealed that the intron-exon structure for easE from C. purpurea is incorrect in the NCBI database. The investigations of key enzymes from C. purpurea, A. fumigatus and P. commune in this study provided new insights in the differentiation of ergot alkaloid biosynthesis. The expression of the genes easA and easG from C. purpurea and the purification and biochemical characterization of the recombinant proteins showed that EasG alone catalyses, via a non-enzymatic adduct with reduced glutathione, the conversion of chanoclavine-I aldehyde to agroclavine. The overproduced EasA seems inactive and may lose its function during evolution. A reaction mechanism was proposed for the conversion of chanoclavine-I aldehyde to agroclavine, whereas one isomerisation and one reduction step was necessary. It was demonstrated that EasG was responsible for the reduction step and a non-enzymatic adduct with reduced glutathione (GSH) for the isomerisation. NADPH was required as cofactor for the EasG reaction. The structure of agroclavine was unequivocally elucidated by NMR and MS analyses. By using a combination of FgaOx3 from A. fumigatus and EasG from C. purpurea it was demonstrated that both enzymes catalyse the reaction from chanoclavine-I aldehyde to festuclavine and pyroclavine. It had been shown previously, that FgaOx3 and FgaFS from A. fumigatus together produce only festuclavine. For detailed investigations on the conversion of chanoclavine-I aldehyde to festuclavine and pyroclavine the orthologues of fgaOx3 and fgaFS from P. commune NRRL2033, fgaOx3pc and fgaFSpc, were amplified and expressed. The combinations of all orthologues from C. purpurea, A. fumigatus and P. commune revealed that in A. fumigatus and P. commune, in contrast to the reaction mechanism in C. purpurea, two reduction steps are required for the conversion of chanoclavine-I aldehyde to festuclavine and pyroclavine. It was shown that FgaOx3 or FgaOx3pc catalysed the first reduction step and the imine reductases FgaFS, FgaFSpc or EasG the second. More importantly, the ratio of pyroclavine to festuclavine was controlled by the reduction of an imine intermediate catalysed by FgaFS, FgaFSpc or EasG, and not by the reduction step catalysed by the old yellow enzymes FgaOx3 or FgaOx3pc.

Bibliographie / References

  1. Abb. 6-10: A: Prenyltransferasen, B: FAD-abhängige Oxidoreduktasen.
  2. Abb. 6-11: A: old yellow enzymes, B: Reduktasen.
  3. Abb. 6-13: Sequenzvergleich von FgaOx1 nach der NCBI-Datenbank mit der FGENESH-Vorhersage.
  4. Abb. 6-18: Primärsequenz von FtmO. Die Ankyrin repeats wurden unterstrichen.
  5. Abb. 6-19: Sekundärstruktur-Vorhersage für das Protein FtmO. Die Ankyrin repeats wurden in der Cartoon-Darstellung abgebildet.
  6. Abb. 6-20: 1 H-NMR-Übersichtsspektrum des authentischen Agroclavin-Standards in der protonierten Form aufgenommen in CD 3 OD.
  7. Abb. 6-21: 1 H-NMR-Übersichtsspektrum des enzymatischen Produkts von EasG in der protonierten Form aufgenommen in CD 3 OD.
  8. Abb. 6-23: Vergrößerung des 1 H-NMR-Spektrums des authentischen Agroclavin- Standards als freie Base in CDCl 3 .
  9. Abb. 6-24: DQF-COSY-Übersichtsspektrum des authentischen Agroclavin-Standards als freie Base in CDCl 3 .
  10. Abb. 6-25: Vergrößerungen des DQF-COSY-Spektrums des authentischen Agroclavin- Standards als freie Base in CDCl 3 .
  11. Abb. 6-26: ROESY-Übersichtsspektrum des authentischen Agroclavin-Standards als freie Base in CDCl 3 .
  12. Abb. 6-27: Vergrößerungen des ROESY-Spektrums des authentischen Agroclavin- Standards als freie Base in CDCl 3 .
  13. Abb. 6-28: HSQC-Übersichtsspektrum des authentischen Agroclavin-Standards als freie Base in CDCl 3 .
  14. Abb. 6-29: Vergrößerungen des HSQC-Spektrums des authentischen Agroclavin- Standards als freie Base in CDCl 3 .
  15. Abb. 6-2: Multi-Proteinsequenzvergleiche von 23 orthologen N-Methyltransferase- Genen.
  16. Abb. 6-30: HMBC-Übersichtsspektrum des authentischen Agroclavin-Standards als freie Base in CDCl 3 .
  17. Abb. 6-33: Positives ESI-MS-Spektrum des isolierten Agroclavins, theoretische Masse [M+1] + :239,2.
  18. Abb. 6-34: Positives ESI-MS-Spektrum des isolierten Chanoclavin-I-Aldehyd-DTT Intermediats, theoretische Masse [M+1] + :409,2.
  19. Abb. 6-35: 1 H-NMR-Übersichtsspektrum des Pyroclavins in protonierter Form aufge- nommen in CD 3 OD.
  20. Abb. 6-36: Vergrößerungen des 1 H-NMR-Spektrums des Pyroclavins in protonierter Form aufgenommen in CD 3 OD.
  21. Abb. 6-37: 13 C-NMR-Übersichtsspektrum des Pyroclavins in protonierter Form aufge- nommen in CD 3 OD.
  22. Abb. 6-38: DQF-COSY-Übersichtsspektrum des Pyroclavins in protonierter Form auf- genommen in CD 3 OD.
  23. Abb. 6-39: Vergrößerungen des DQF-COSY-Spektrums des Pyroclavins in protonierter Form aufgenommen in CD 3 OD.
  24. Abb. 6-40: NOESY-Spektrum des Pyroclavins in protonierter Form aufgenommen in CD 3 OD.
  25. Abb. 6-41: Vergrößerungen des NOESY-Spektrums des Pyroclavins in protonierter Form aufgenommen in CD 3 OD.
  26. Abb. 6-42: HSQC-Übersichtsspektrums des Pyroclavins in protonierter Form aufge- nommen in CD 3 OD.
  27. Abb. 6-43: Vergrößerungen des HSQC-Spektrums des Pyroclavins in protonierter Form aufgenommen in CD 3 OD.
  28. Abb. 6-45: Vergrößerungen des HMBC-Spektrums des Pyroclavins in protonierter Form aufgenommen in CD 3 OD.
  29. Abb. 6-46: Positives ESI-MS-Spektrum des isolierten Pyroclavins, theoretische Masse [M+1] + :241,17.
  30. Abb. 6-48: Vergleich der Membrandomänen-Vorhersagen der Programme TMHMM-
  31. Abb. 6-4: Multi-Proteinsequenzvergleiche von 23 orthologen Katalase-Genen.
  32. Abb. 6-5: Multi-Proteinsequenzvergleiche von 22 orthologen Alkohol-Dehydrogenase- Genen. Die Alkohol-Dehydrogenase aus Trichophyton equinum CBS127.97 konnten nicht in die Analyse einbezogen werden, da die Genomsequenz unvollständig war.
  33. Abb. 6-6: Multi-Proteinsequenzvergleiche von 16 orthologen old yellow enzyme-Genen.
  34. Abb. 6-7: Multi-Proteinsequenzvergleiche von 16 orthologen Reduktase-Genen.
  35. Ruhr-Universität Bochum, Bachelor-Studium der Biochemie mit dem Schwerpunkt " Biomolekulare Chemie " Bachelorarbeit: " Quantitative Charakterisierung der Interaktion zwischen Ras und RASSF1C " angefertigt in der Arbeitsgruppe Proteininteraktionen bei Prof. Dr. Christian Herrmann 10.2006 – 10.2008
  36. TMpred für FgaOx1. Die putativen Membrandomänen wurden unterstrichen und das Startcodon der EasE-Proteinsequenz (NCBI-Datenbank) markiert. Die Konsensussequenz der Membrandomänen-Vorhersage beider Programme wurde durch " * " markiert.
  37. Emscherschule Oberhausen, Grundschule 06.1993 – 06.2002
  38. ESI-MS-Spektren des isolierten Agroclavins und des Chanoclavin-I- Aldehyd-DTT Intermediats
  39. Fortsetzung Abb. 6-2:
  40. Fortsetzung Abb. 6-4:
  41. Fortsetzung Abb. 6-6:
  42. Membrandomänen-Vorhersagen für FgaOx1 und EasE Abb. 6-47: Vergleich der Membrandomänen-Vorhersagen der Programme TMHMM-
  43. MS-Spektrum des isolierten Pyroclavins
  44. NMR-Spektren des isolierten Pyroclavins
  45. Phylogenetische Stammbäume der orthologen Ergotalkaloidgene Abb. 6-8: A: Katalysen; B: Dehydrogenasen.
  46. Vergleich der FgaOx1-Sequenz des NCBI-Eintrags mit der FGENESH-Vorhersage


* Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten