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Zusammenfassung:
Bei der Passage durch den männlichen Reproduktionstrakt interagieren Spermatozoen mit Faktoren, die u.a. vom Nebenhoden sezerniert werden. Die daraus resultierende Modifikation der Spermatozoen ist essentiell für die Ausreifung zu voll funktionsfähigen Keimzellen. Bei der Ausdifferenzierung im Nebenhoden spielen vermutlich u. a. auch die Epididymosomen (apokrin sekretierte Nebenhodenvesikel) eine wichtige Rolle. In vorausgehenden Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass sich die Plasmamembran-Ca2+-ATPase Isoform 4 (PMCA4) Spleißvarianten-Ausstattung in der Membran von Bullenspermien von PMCA4b in Caputspermien zu PMCA4a in Caudaspermien ändert. Zudem nahm auch die Ca2+-ATPase Aktivität der Spermien während der Passage durch den Nebenhoden signifikant zu. Die Möglichkeit eines Transfers der PMCA4a von Epididymosomen auf Spermien wurde postuliert (Sanchez-Luengo et al. 2004,Brandenburger et al. 2011). Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die fusogene Eigenschaft boviner Epididymosomen näher zu untersuchen. Dafür wurden Nebenhodenvesikel aus den verschiedenen Nebenhodenabschnitten isoliert und sowohl morphologisch, als auch biochemisch charakterisiert. Weiterhin wurde der vesikuläre Transfer von Membrankomponenten (Lipide, Proteine) und speziell der potentielle Transfer der PMCA auf bovine Nebenhodenspermien untersucht. Elektronenmikroskopische ntersuchungen zeigten, dass Cauda Epididymosomen größer sind als Caput Epididymosomen. Lipidanalysen von Caput- und Cauda Epididymosomen belegten eine Zunahme des Cholesterin/Phospholipid-Verhältnisses bei einer Abnahme der Cholesterol- und der Phospholipidkonzentration. Hauptanteilig konnten die Phospholipide Phosphatidyethanolamin (PE), Phosphatidylcholin (PC) und Sphingomyelin(SM) nachgewiesen werden, wobei sich der Gehalt in Caput- und Cauda Epididymosomen nicht signifikant veränderte. Bei der Proteinanalyse spezialisierte sich die Autorin auf die PMCA. Mittels Westernblot-Analysen konnte gezeigt werden, dass in Cauda Vesikeln mehr PMCA4a nachzuweisen war als in Caput Vesikeln. Auch die Ca2+-ATPase Aktivität stieg von Caput- zu Cauda Epididymosomen signifikant an. Um in in vitro Experimenten die fusogene Eigenschaft der Epididymosomen mit Spermien zu untersuchen, wurden bovine Epididymosomen mit dem Fluoreszenzfarbstoff Octadecylrhodamin B (R18) markiert. Für Caputspermien konnte eine höhere Fusionsrate als für Caudaspermien nachgewiesen werden. Der für die Fusion optimale pH lag dabei im sauren Bereich (pH 5 - 6). Lipidanalysen von Nebenhodenspermien belegten eine Abnahme des Cholesterin/Phospholipid-Verhältnisses von Caput- zu Caudaspermien. Dies konnte auch nach in vitro Fusion von Caputspermien mit Epididymosomen erzielt werden. Daher wird postuliert, dass diese Veränderungen ein Ergebnis aus der Interaktion der Spermien mit den Epididymosomen sind. In vivo konnte in Spermien eine Abnahme von PE, PC und SM im Verlauf des Nebenhodentraktes dokumentiert werden, die jedoch in vitro nicht nachgeahmt werden konnte. Nach Markierung der Epididymosomen mit Biotin konnte eine Übertragung Biotin-markierter Proteine von Epididymosomen auf die Nebenhodenspermienmembran mittels in vitro Fusion gezeigt werden. Die Ca2+-ATPase-Aktivität nahm zwar signifikant nach in vitro Fusion von Epididymosomen mit Nebenhodenspermien zu, ob aber auch die PMCA4a übertragen wird, konnte mittels Immunhistologie nicht abschließend geklärt werden, da der Antikörper gegen die Spleißvariante PMCA4a auf Spermienausstrichen unzureichend färbte. Lediglich mit dem Antikörper gegen PMCA4 konnte eine leichte Fluoreszenzzunahme im Mittelstück dokumentiert werden, die auf eine Übertragung hindeuten könnte. Weiterhin konnte in vorausgehenden Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass die Ca2+-ATPase Aktivität in Nebenhodenspermien organspezifisch (z.B. keine signifikante Stimulation in Herz und Niere) durch das Bläschendrüsenprotein PDC-109 signifikant stimuliert werden kann (Sanchez-Luengo et al. 2004). Diese Stimulation konnte in der vorliegenden Arbeit auch für Epididymosomen und Spermien nach in vitro Fusion dokumentiert werden. Es ist bekannt, dass PDC-109 an Phospholipide bindet und auch die Aktivität der PMCA durch Phospholipide beeinflusst werden kann. Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob es einen Zusammenhang zwischen der Lipidveränderung und der erhöhten Ca2+-ATPase Aktivität in Spermien nach der Fusion gibt. Zusammenfassend führt die Transsekretion (Zell-zu-Zelltransfer) zwischen Epididymosomen und Spermien zur Übertragung von Lipiden und Proteinen mit Einfluss auf die Ca2+-ATPase-Aktivität.

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31. Abb. 44: Fluoreszenzmessung am Delta Scan Illuminationssystem (Emission λ= 580, Extinktion λ= 560). Nach Zugabe von R18 markierten Epididymosomen (e) (bei t= 30 sec.) zu unmarkierten bovinen Nebenhodenspermien (s) konnte ein Anstieg der Fluoreszenz gemessen werden. Die Messung wurde im Puffer mit 0,32 mol/L Sucrose mit 20 mmol/L MES bei pH= 5 durchgeführt. Nach ca. t= 600 sec. erfolgte die Zugabe von 1% TritonX-100 (v/v, Endkonzentration), wodurch der maximale Fluoreszenzanstieg erreicht werden konnte. Die Abbildung zeigt exemplarisch eine Messung, von jeder Spermien/Vesikel-Kombination.
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