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Titel: Synthese und Charakterisierung von Inhibitoren der hämagglutininspaltenden Proteasen Furin und HAT
Autor: Sielaff, Frank
Weitere Beteiligte: Steinmetzer, Torsten (Prof. Dr. )
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0785
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0785
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-07855
DDC: Naturwissenschaften
Titel(trans.): Synthesis and characterization of the haemagglutinin-cleaving proteases furin and HAT

Dokument

Schlagwörter:
Grippe, Serinprotease, Furin, flu, Enzyminhibitor, Vogelgrippe, HAT, Inhibitor, HAT, influenza, Influenza-A-Virus, inhibitor, furin

Zusammenfassung:
In der vorliegenden Arbeit wurden Inhibitoren der hämagglutininspaltenden Proteasen Furin und HAT synthetisiert und charakterisiert. Während die Proproteinkonvertase Furin das Hämagglutinin (HA) hochpathogener Influenzaviren vom Subtyp H5 und H7 aktiviert, bewirkt die trypsinartige Serinprotease HAT die Spaltung des HA saisonaler Influenzaviren der Subtypen H1, H2 und H3. Die entwickelten Hemmstoffe dieser Proteasen können somit als Ausgangsstoffe für die Entwicklung neuer antiviraler Wirkstoffe zur Therapie der Influenza dienen. Ein Bis-Amidinohydrazonderivat wurde in einem screening als Startpunkt für die Entwicklung neuer niedermolekularer Furininhibitoren identifiziert. In vier Syntheseserien wurden Furininhibitoren dieses Typs dargestellt. In der ersten Serie wurden kommerziell erhältliche Carbonylverbindungen als Ausgangsmaterial verwendet. Die wirksamste Verbindung dieser Serie mit einem Ki-Wert von 1,5 µM ist der vom Terephthalaldehyd abgeleitete Inhibitor. In zwei weiteren Serien wurden Derivate mit drei oder vier basischen Funktionen synthetisiert. Die Kopplung von 4 Guanidinobuttersäure an die Leitstruktur MI-0007 in der zweiten Serie und die Darstellung tetrabasischer Verbindungen unter Verwendung von in der dritten Serie führten zu Inhibitoren mit Hemmkonstanten von 0,5 - 0,6 µM. Ein aus der Literatur bekanntes, vom Salicylaldehydbenzylether abgeleitetes, monovalentes Amidinohydrazon mit einem Ki-Wert von 11,8 µM wurde als Leitstruktur einer vierten Serie von Furininhibitoren genutzt. Jedoch waren die Verbindungen dieser Serie weniger wirksam als die entsprechende aus der Literatur bekannte Ausgangsverbindung. Mit Ausnahme einer Verbindung, weisen alle im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten Amidinohydrazonderivate eine hohe Selektivität gegenüber den untersuchten trypsinartigen Serinproteasen Thrombin, Faktor Xa und Plasmin auf (Ki-Werte > 30 µM). Für die trypsinartige Serinprotease HAT wurden bisher nur wenige Inhibitoren in der Literatur beschrieben. Deshalb begannen die Arbeiten zur Entwicklung der HAT-Inhibitoren mit einer Testung von im Arbeitskreis verfügbaren Verbindungen. Neben substratanalogen Inhibitoren mit einem C terminalen 4-Amidinobenzylamid konnten Verbindungen mit einem zentralen 3-Amidinophenylalanin des 3-TAPAP-Typs als Startpunkte für die Entwicklung von HAT-Hemmstoffen identifiziert werden. In sämtliche substratanaloge Inhibitoren wurde in P4- ein Benzylsulfonylrest und in P1-Position ein 4-Amidinobenzylamid eingebaut. In einer ersten Serie mit einem Prolin als P2-Rest wurden in P3 Position verschiedene D-Aminosäurereste akzeptiert, besonders jedoch das basische D-Arginin oder D-homo-Arginin. Akzeptiert werden auch hydrophobe Aminosäurederivate, wie ein tert.-butyl-geschütztes D-Asp oder D-Glu (Ki < 40 nM). Aufgrund der Präferenz für basische und hydrophobe Aminosäurereste in P3-Position, wurden in einer zweiten Serie die Seitenketten von D-Asp und D-Glu mit verschiedenen zyklischen Aminen modifiziert. Die wirksamste Verbindung wurde durch Kopplung von 1-(2-Pyrimidyl)piperazin an die Seitenkette von D-Glu erhalten und hemmt HAT mit einem Ki-Wert von 17 nM. Da substratanaloge Inhibitoren mit einem P2-Prolin häufig auch andere trypsinartige Serinproteasen hemmen, wurde der Einfluss anderer Aminosäuren in P2-Position in Kombination mit D-Arginin als P3-Rest untersucht. Die stärkste Hemmwirkung innerhalb dieser Serie mit Ki Werten < 30 nM wurde für kleine hydrophobe Aminosäurereste, wie 2-Aminobuttersäure (Abu), Norvalin (Nva), Valin oder Alanin gefunden. Ein Vorteil der Derivate mit Abu oder Nva in P2-Position ist deren verbesserte Selektivität gegenüber den Proteasen Thrombin, Faktor Xa und Plasmin. Die Verbindung Bzls-D-Arg-Nva-4-Amidinobenzylamid ist mit einer Hemmkonstante von 15 nM der erste Inhibitor, der die anderen getesteten Proteasen schwächer hemmt und somit die höchste Selektivität für HAT aufweist. Ausgewählte substratanaloge Inhibitoren wurden in Zellkulturversuchen eingesetzt, um die Hemmung der Vermehrung von Influenzaviren zu untersuchen. Eine besonders starke Hemmwirkung auf Influenzaviren der Subtypen H1 und H3 wurde durch Inhibitoren mit Norvalin oder 2-Aminobuttersäure in P2-Position bestimmt. Die Inhibitoren weisen darüber hinaus keine signifikante Zytotoxizität auf, so dass die reduzierte Virusausbreitung auf die HAT-Hemmung zurückzuführen ist. In der vorliegenden Arbeit wurden zahlreiche substratanaloge Inhibitoren identifiziert, die HAT mit Ki-Werten < 30 nM hemmen. Im Gegensatz zu den bereits etablierten antiviralen Wirkstoffen hemmen alle im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Furin- und HAT-Inhibitoren Zielstrukturen des Wirts. Deshalb sollten auch bei längerer Verwendung dieser Verbindungen keine Resistenzen auftreten.

Summary:
Inhibitors of the haemagglutinin cleaving proteases furin and HAT were synthesized and characterized in this thesis. While the proproteinconvertase furin is activating the haemagglutinin (HA) of highly pathogenic influenza viruses of the subtype H5 and H7, the trypsin-like serine protease HAT activates the HA of seasonal influenzaviruses of the subtypes H1, H2 and H3. Therefore, the described inhibitors may be useful tools for the development of new antiviral drugs for the treatment of the flu. In a first screening a bis-amidinohydrazone-derivate was identified as a lead structure for new low molecular weight furin inhibitors, which was modified in four subsequent synthesis cycles. Commercially available carbonyl compounds were used in a first series. The most potent derivative was derived from terephthalaldehyde and possesses an inhibitory constant of 1,5 µM. Inhibitors with three or four basic residues were obtained from second and third series. The coupling of 4-guanidionbutyric acid to the lead structure in the second series and the dimerization of the initial screening hit with chloroaceticacidchloride led to compounds with a inhibitory potency of 0,5 to 0,6 µM. A known salicylaldehyde benzylether-derived compound was used as a lead structure of the fourth series. However, all inhibitors from this attempt were less potent than the lead structure. With one exception all amidinohydrazone derived inhibitors from this thesis feature a high selectivity against the related trypsin-like serineproteases thrombin, factor Xa and plasmin (Ki > 30 µM). Until now only few inhibitors for the trypsin-like serinportease HAT were described. Thus, the first attempt in this field was the screening of available compounds for HAT inhibition. Besides, substrate analogue compounds with a 4-amidinobenyzlamide moiety on the C-terminal part and inhibitors with a 3-amidinophenylalanine of the TAPAP-type were identified as possible starting points for the development of HAT inhibitors. For all substrate analogue inhibitors a P4-benzylsulfonyl residue and a P1-Amidinobenzylamidine residue were used. In a first series with a proline in P2-position, several d-configurated aminoacids were well-accepted in P3-position. Especially d-Arg and d-homo-Arg were favored as a P3-residue. Nevertheless, hydrophobic derivatives, like a tert.-butyl protected d-Asp or d-Glu, were also well-suited for incorporation. Due to the preference of HAT for basic or hydrophobic amino acids in P3, cyclized amines were coupled to the side chains of d-Asp or d-Glu in a second series. Most potent compound from this attempt was obtained via coupling of 1-(2-pyrimidyl)piperazin to the free side chain of d-Glu (Ki = 17 nM). Substrate analogue inhibitors with a P2-Proline are common inhibitors of several trypsine-like proteases. Hence, the influence of other amino acid residues replacing the proline was examined keeping d-Arg in P3-position. Small hydrophobic residues like 2-aminobutyric acid (Abu), norvaline (Nva), Ala or Val are a good replacement for proline and the compounds inhibit HAT with Ki-values below 30 nM. An advantage of these inhibitors is their enhanced selectivity against the other tested proteases thrombin, factor Xa and plasmin. Selected compounds were also tested in cell based assays to examine their ability to suppress viral replication. In these experiments the inhibitors with an Abu or Nva residue in P2-position effectively inhibit the replication of influenza viruses of the subtypes H1 and H3. It should be noted that this effect is not associated with any toxic effects to the cells. Several substrate analogue compounds which inhibit HAT with inhibition constants < 30 nM are presented in this thesis. Contrary to until now known antiviral drugs, the synthesized compounds are targeting host cell proteases. Therefore, there will be no rising of resistances against these drugs.


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