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Titel: Die P-loop ATPase MipZ - Mechanismus der Bildung eines Proteingradienten in einer prokaryotischen Zelle
Autor: Kiekebusch, Daniela
Weitere Beteiligte: Thanbichler, Martin (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0657
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0657
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-06574
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): The P-loop ATPase MipZ - mechanism of protein gradient formation in a prokaryotic cell

Dokument

Schlagwörter:
Soj, FtsZ, DNA-Segregationssystem, Zellskelett, DNA partitioning protein, ParA-ähnliche ATPase, ParA-like ATPase, FtsZ, Min system, Min-System, Soj

Zusammenfassung:
Biologische Systeme, sei es auf zellulärer oder einer höher geordneten Ebene, zeichnen sich durch eine erstaunliche Komplexität aus. Diese beruht unter anderem auf der räumlichen Heterogenität regulatorischer Schlüsselkomponenten. Das wohl am besten untersuchte Beispiel stellen extrazelluläre Morphogene dar, die in multizellulären Organismen durch Ausbildung eines auf Diffusion basierenden Konzentrationsgradienten zahlreiche Entwicklungsprozesse regulieren. Dieses Muster setzt sich in Eukaryoten auf der zellulären Ebene fort, wo Konzentrations- und Phosphorylierungsgradienten sowie Ran-GTP-Gradienten an der Homöostase der Zellgröße, der Regulation der Chromosomensegregation, der Zellteilung, der Adhäsion und der Zellmigration beteiligt sind. Lange Zeit wurde davon ausgegangen, dass solche Gradienten in prokaryotischen Organismen aufgrund ihrer geringen Größe nicht aufrecht erhalten werden können. Heutzutage ist jedoch bekannt, dass diffusionsbasierte Phosphorylierungsgradienten in Bakterien sowohl an der räumlichen Organisation der Zelle als auch an der Etablierung einer Asymmetrie beteiligt sind. Die Existenz eines statischen Konzentrationsgradienten in Bakterien wurde durch die Entdeckung und funktionelle Charakterisierung des MipZ-Proteins gezeigt. Diese orphan P-loop-ATPase bildet in dem α-Proteobakterium C. crescentus einen bipolaren Gradienten aus, welcher die Positionierung der Teilungsebene kontrolliert. MipZ interagiert mit dem parS/ParB-Nukleoproteinkomplex in der Nähe des chromosomalen Replikationsursprungs. Nach Eintritt in die S-Phase werden die replizierten Ursprünge getrennt und an den beiden Zellpolen verankert. Als Resultat bildet MipZ einen Konzentrationsgradienten aus, dessen Maxima in den polaren Bereichen liegen und dessen Minimum sich in der Zellmitte befindet. Da MipZ ein Inhibitor der Z-Ring-Assemblierung ist, beschränkt es auf diese Weise die Positionierung der Teilungsebene auf die Mitte der Zelle. In der vorliegenden Arbeit wurde der dem Konzentrationsgradienten von MipZ zugrundeliegende Mechanismus charakterisiert. Unter Zuhilfenahme von Substitutionsvarianten, die den ATPase-Zyklus von MipZ auf der Ebene der Nukleotidbindung, der ATP-abhängigen Dimerisierung oder der ATP-Hydrolyse unterbrechen, konnte gezeigt werden, dass die Grundlage des Gradienten ein durch die ATPase-Aktivität kontrollierter Wechsel zwischen einer monomeren und einer dimeren Form ist, welche unterschiedliche Interaktionsnetzwerke und als Folge dessen abweichende Mobilitäten in vivo zeigen. Monomeres MipZ interagiert mit ParB und wird dadurch zu den Polen rekrutiert, wohingegen dimeres MipZ die biologisch aktive Form darstellt, die mit FtsZ interagiert. Darüber hinaus bindet das MipZ-Dimer an das Nukleoid, wodurch es in seiner Beweglichkeit gegenüber dem Monomer eingeschränkt wird. Da MipZ-Monomere durch die Interaktion mit ParB in den polaren Bereichen konzentriert werden, erfolgt die Dimerisierung mit großer Wahrscheinlichkeit am Pol. Von dort ausgehend diffundieren Dimere, verlangsamt durch ihre Assoziation mit der DNA, in Richtung Zellmitte, so dass der Gradient als eine asymmetrische Verteilung von MipZ-Dimeren betrachtet werden kann. Eine mathematische Modellierung des Systems auf Grundlage der experimentellen Daten könnte dieses Modell unterstützen. Ferner ist eine nähere Betrachtung der MipZ-FtsZ-Interaktion von besonderem Interesse, vor allem mit Hinblick auf die ebenfalls nur ungenügend verstandene Interaktion von FtsZ mit MinC, welches der Inhibitor der polaren Z-Ring-Assemblierung in E. coli und B. subtilis ist. Ein Sequenzvergleich mit weiteren P-loop-ATPasen zeigte, dass sich MipZ in die Mrp/MinD-Familie von P-loop-ATPasen einordnen lässt. Mitglieder dieser Familie sind an der Regulierung diverser zellulärer Abläufe beteiligt, wie z. B. Stickstofffixierung, Chromosomensegregation und Zellteilung. Eine eingehende phylogenetische Analyse von MipZ-Homologen veranschaulichte, dass diese eine distinkte, bisher nicht definierte Unterfamilie der Mrp/MinD-Proteine bilden, die am nächsten mit den in der Chromosomensegregation involvierten ParA/Soj-Proteinen verwandt ist. Mikrobielle Genome kodieren zahlreiche weitere orphan P-loop-ATPasen und es bleibt abzuwarten, wo sich diese einordnen lassen und welche Funktionen sie übernehmen.

Summary:
Protein gradients have a key role in the spatial regulation of biological processes, thereby contributing to the complexity of both prokaryotic and eukaryotic organisms. In eukaryotes, intracellular protein and protein phosphorylation gradients were shown to be involved in embryonic development, mitotic spindle morphogenesis and cell division. Similarly, phosphorylation gradients are critical for the establishment of asymmetry in prokaryotes. However, well-studied examples for protein concentration gradients are still rare for these organisms. At the scale of a small prokaryotic cell, intracellular concentration gradients have long been assumed to be unsustainable due to the process of diffusion. Nevertheless, steady-state concentration gradients can be maintained in bacteria, as exemplified by the bipolar gradient of the P-loop-ATPase MipZ which is required for proper division site placement in the α-proteobacterium Caulobacter crescentus. MipZ interacts with a kinetochore-like nucleoprotein complex formed by the chromosome segregation protein ParB in the vicinity of the chromosomal origin of replication. Upon entry into S-phase, the two newly duplicated origin regions are partitioned and sequestered to opposite cell poles, resulting in a bipolar distribution of MipZ with a defined concentration minimum at mid-cell. Acting as a direct inhibitor of the essential cell division protein FtsZ, MipZ thus restricts cytokinesis to the cell center. In this study, the mechanism underlying the formation of the MipZ gradient was analyzed. Based on the crystal structures of the apo and ATP-bound protein and by means of mutant variants of MipZ, I dissected the role of nucleotide binding and hydrolysis. Gradient formation is found to rely on nucleotide-regulated alternation of MipZ between a monomeric and dimeric form. MipZ monomers interact with ParB, which results in the recruitment of MipZ to the polar regions of the cell. Upon ATP binding, MipZ dimerizes and is converted into its biologically active form that inhibits FtsZ assembly. Moreover, diffusion of the dimer is decelerated by its association with the nucleoid. The MipZ gradient can thus be envisioned as an asymmetric distribution of dimers that are released from a polar pool and slowly diffuse towards mid-cell. By virtue of the marked differences in the interaction networks and diffusion rates of monomers and dimers, ATP hydrolysis promotes oscillation of MipZ between the polar ParB complexes and pole-distal regions of the nucleoid. The MipZ gradient thus represents the steady-state distribution of molecules in a highly dynamic system, providing a general mechanism for the establishment of protein gradients within the confined space of the bacterial cytoplasm. The generation of a concentration gradient by a P-loop-ATPase of the Mrp/MinD family exemplifies the diverse regulatory strategies and interaction networks that are used by different family members to fulfill their particular function in the cell. Concurrently, the unique features of MipZ identify it as the member of a novel subfamily of Mrp/MinD proteins.


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