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Titel: Identifizierung und Charakterisierung von Siderophorbindungsproteinen aus Bacillus subtilis
Autor: Peuckert, Florian
Weitere Beteiligte: Marahiel, Mohamed A. (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0606
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0606
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-06060
DDC: Chemie
Titel(trans.): Identification and Characterization of Siderophore Binding Proteins from Bacillus subtilis

Dokument

Schlagwörter:
Proteine, MALDI-MS, Eisen, FeuA, iron, CD-Spektroskopie, FpiA, Elektronensprayionisations-Massenspektrometr, Kristallisation, FeuA, FpiA, Siderophor, Kristallographie, siderophore, Affinitätschromatographie, transport, Transport

Zusammenfassung:
Um die Versorgung mit dem essentiellen Spurenelement Eisen sicherzustellen, haben Mikroorganismen eine Vielzahl von Strategien entwickelt. Die Sekretion von niedermolekularen, chelatisierenden Molekülen, den sogenannten Siderophoren, nimmt unter den bakteriellen Eisenakquirierungsstrategien eine besonders prominente Rolle ein. Die Wiederaufnahme der eisenbeladenen Siderophore durch Mikroorganismen stellt dabei einen Schlüsselprozess dar und ist daher ein attraktives Ziel für potentielle Antibiotika. Hochaffine Bindung der Siderophore erfolgt durch Substratbindungsproteine, die Teil von ATP-Bindungskassetten-Transportern sind. Die potentielle Ausnutzung der Transportwege durch Wirkstoffe verlangt eine umfassende funktionelle und strukturelle Charakterisierung der beteiligten Proteine. In dieser Arbeit wurde ein Affinitätschromatographie-basiertes Verfahren zur Isolierung und Identifizierung eines Substratbindungsproteins aus Zelllysaten durch direkte Wechselwirkung mit seinem natürlichen Liganden entwickelt. Synthetische Derivate des Siderophors Petrobactin wurden auf einer Agarose‒Streptavidin-Matrix immobilisiert und mit dem Zelllysat einer Bacillus subtilis-Kultur behandelt, was die erfolgreiche Identifizierung des Petrobactin- Bindungsproteins FpiA ermöglichte. Die anschließende biochemische und physiologische Charakterisierung des Proteins bestätigte seine Signifikanz für die Petrobactin-Aufnahme und belegt damit das Potential dieser neuen Methode. Weiterhin wurde das Triscatecholat-Bindungsprotein FeuA aus B. subtilis strukturell und funktionell charakterisiert. Cokristallstrukturen mit den Siderophoren Bacillibactin und Enterobactin sowie dem Siderophor-Mimetikum mecam zeigten einen nahezu identischen Bindungsmodus für die drei verwandten, aber dennoch verschiedenen Eisenkomplexanionen. Eine basische Triade in der Bindungstasche wurde als Hauptbindungsmotiv für die Substrate identifiziert und durch ortsgerichtete Mutagenese und nachfolgende Charakterisierung der Varianten durch Fluoreszenzspektroskopie und ligandenabhängige Schmelzpunktanalyse untersucht. Kristallographische und CD-spektroskopische Experimente zeigten, dass die Bindungstasche nur Lambda-stereokonfigurierte Siderophore zulässt, daher wird beispielsweise die Delta-Stereokonfiguration des Eisenkomplexes von Enterobactin bei Bindung durch FeuA invertiert. Auffällig war der nahezu identische Bindungsmodus des Proteins für die verschiedenen Substrate, welcher mit einer Kippbewegung der zwei Domänen von FeuA um etwa 20° einhergeht, der größten bisher experimentell beobachteten Domänenbewegung eines Substratbindungsproteins der Klasse III. Diese Ähnlichkeit des Bindungsmodus impliziert seine Bedeutung für die nachfolgende Erkennung von FeuA durch die kognaten Transmembrandomänen FeuBC des Transporters, die durch Positionierung konservierter Glutamatreste auf der Oberfläche von FeuA ermöglicht wird. Diese Arbeit zeigt einen neuartigen Ansatz zur Identifizierung bakterieller Substratbindungsproteine und bietet einen detaillierten strukturellen und funktionellen Einblick in die Bindung von Triscatecholatsiderophoren durch solche Proteine.

Summary:
To ensure the supply with the essential nutrient and trace element iron, microorganisms have evolved several strategies. The secretion of low molecular weight, chelating molecules, the so called siderophores, takes a very prominent role among the bacterial iron acquisition strategies. The uptake of the iron-loaded siderophores through microorganisms constitutes a key step in this strategy and is therefore an attractive target for potential antibiotic agents. High affinity binding of siderophores is accomplished by substrate binding proteins, which are part of ATP-binding cassette transporters. The potential exploitation of the transport mechanisms through pharmacological agents demands a comprehensive functional and structural characterization of the involved proteins. In this work an affinity chromatography-based approach for the isolation and identification of substrate binding proteins from crude cell extracts through direct interaction with its natural ligand has been established. Synthetic derivatives of the siderophore petrobactin were immobilized on an agarose−streptavidin matrix and treated with the cell lysate of a Bacillus subtilis culture, which allowed the successful identification of the petrobactin binding protein FpiA. The subsequent biochemical and physiological characterization of the protein confirmed its significance for petrobactin import and proved therefore the potential of this new method. Furthermore, the triscatecholate binding protein FeuA from B. subtilis was structurally and functionally characterized. Cocrystal structures with the siderophores bacillibactin and enterobactin and the siderophor mimic mecam showed a nearly identical binding mode for these three related, but nevertheless distinct iron-complexanions. A basic triad within the binding pocket was identified as the main binding motif for the substrates and was examined through site-directed mutagenesis and subsequent characterization of the variants through fluorescence spectroscopy and ligand-dependent melting point analysis. Crystallographic and CD-spectroscopic experiments showed that the binding pocket accepts solely lambda-stereoconfigured substrates, therefore the delta-stereoconfiguration of the iron-complex of enterobactin is inverted through binding by FeuA. Noticeable was the nearly identical binding mode of the protein for the different substrates, which is attended by a tilting of the two domains of FeuA of about 20°, the greatest experimentally observed domain movement of a class III substrate binding protein so far. This similarity of the binding modes implies its importance for the subsequent recognition of FeuA by the cognate transmembrane domains FeuBC of the transporter, which is facilitated through the correct positioning of conserved glutamate residues on the surface of FeuA. This work shows a new approach for the identification of bacterial substrate binding proteins and presents detailed structural and functional insights into the binding of triscatecholate siderophore by such proteins.


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