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Titel: Cloning of butyrogenic genes from Clostridium difficile and metabolic pathway reconstitution in Escherichia coli
Autor: Aboulnaga, El-Hussiny Ahmed Ahmed Ali
Weitere Beteiligte: Selmer, Thorsten (Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0604
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0604
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-06044
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Klonierung und Expression von Clostridium difficile Butyrate synthetische Gene in Escherichia coli

Dokument

Schlagwörter:
Butyrat Produktion,, Enzymcharakterisierung, Stoffwechselweg Design, Butyrate production, cloning and expression butyrogenic genes, enzyme characterization, Metabolic pathway design, Butyrat Produktion,, Klonierung und Expression butyrogene Gene, Enzymcharakterisierung, Stoffwechselweg Design, Klonierung und Expression butyrogene Gene

Summary:
Die vorliegende Arbeit stellt die Entwicklung eines neuartigen Modellsystems dar, welches die Implementierung kompletter Stoffwechselmodule in geeignete Akzeptororganismen zur systematischen Anwendung in der synthetischen Biologie erlaubt. Das bisher wenig untersuchte butyrogene Stoffwechselmodul aus Clostridium difficile wurde hierzu in Escherichia coli transferiert, bestehend aus den individuellen Enzymen Thiolase (EC 2.3.1.9), -Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase (EC 1.1.1.157), Crotonase (EC 4.2.1.17), Butyryl-CoA-Dehydrogenase einschließlich der zwei Elektronen transferierenden Flavoprotein-Untereinheiten (EC 1.3.99.2), Phosphotransbutyrylase (EC 2.3.1.19) sowie Butyratkinase (EC 2.7.2.7). Die Enzyme wurden zunächst einzeln in E. coli produziert, funktionell getestet und in vitro charakterisiert. Die dabei erhaltenen kinetischen Parameter sowie Daten zur Substratspezifität und Stabilität gaben Aufschluss über die Fähigkeit der Enzyme zur Produktion von Intermediaten innerhalb von Modulen zur Produktion kurzkettiger Fettsäuren. In diesem Kontext wurden neue Aktivitätstests für Phosphotransbutyrylase und Butyratkinase etabliert. Im Zuge der Entwicklung einer vereinfachten Methode zur Messung der verzweigten Butyryl-CoA-Dehydrogenase in der physiologischen Reaktionsrichtung konnte die Annahme erhärtet werden, das C. difficile entgegen dem intensiv untersuchten C. acetobutylicum mithilfe dieses Enzyms zur Energiekonservierung mit reduziertem Ferredoxin fähig ist. Der potentielle Einfluss derartiger Enzyme bei der Produktion von Butan-1-ol in rekombinanten Stämmen wird in diesem Kontext diskutiert. Zur Konstruktion des kompletten artifiziellen Stoffwechselmoduls wurden die Gene für oben erwähnte Enzyme erfolgreich zu einem synthetischen Operon assembliert, resultierend in den Expressionsplasmiden pASG.wt_BUTD und pASG.wt_BUTAC, welche sich lediglich in der Herkunft des Butyryl-CoA-Dehydrogenase/ETF-Komplexes unterscheiden. Die Gene für den besagten Komplex stammten entweder aus C. difficile (pASG.wt_BUTD) oder C. acetobutylicum (pASG.wt_BUTAC). Die rekombinanten Butyrogenen Stoffwechselmodule wurden in vivo untersucht durch Kombinationen aus Enzymtests in zellfreien Extrakten und die Analyse des Fermentationsprozesses im Bezug auf Substrataufnahme, Biomasse-, Produkt- sowie Nebenproduktbildung zum Verständnis des Massenflusses innerhalb des Systems. Tatsächlich waren lediglich die rekombinanten Stämme zur Butyrat-Produktion fähig, mit maximalen Konzentrationen von 3,1 bzw. 3,7 mM im Medium. Während keine großen Unterschiede zwischen den beiden rekombinanten Stämmen bezüglich Wachstum, Substratverbrauch und Produktausbeute beobachtet werden konnten, hatte die Herkunft der jeweiligen Butyryl-CoA-Dehydrogenase dramatische Auswirkungen auf die Kinetik der Produktbildung, eine Beobachtung, die besonders im Bezug auf den potentiellen Einsatz in der biotechnologischen Lösemittelproduktion diskutiert wird.

Zusammenfassung:
In this study, a novel strategy for systematic applications in synthetic biology aiming the transfer of metabolic capacities from a donor to an acceptor organism was elucidated. As a model system, it was chosen the butyrate fermentation of Clostridium difficile, which has not been studied in details before. In order to succeed, individual enzymes, thiolase (EC 2.3.1.9), -hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (EC 1.1.1.157), crotonase (EC 4.2.1.17), butyryl-CoA dehydrogenase with its two electron transferring flavoprotein subunits (EC 1.3.99.2), phosphate butyryltransferase (EC 2.3.1.19) and butyrate kinase (EC 2.7.2.7), were initially produced in E. coli in order to demonstrate their functional production, followed by an initial characterization in vitro. Substrate specificity, stability and kinetic parameters were established in order to address their capability for the synthesis of various metabolic intermediates in volatile fatty acid biosynthetic pathways. In this context, novel enzyme tests for phosphate butyryl-transferase and butyrate kinase were developed and a facile method for testing of bi-forking butyryl-CoA dehydrogenase in the physiological reaction was established. Using the latter assay, evidence was obtained for a bi-forking butyryl-CoA dehydrogenase in C. difficile, which could allow energy conservation aided by reduced ferredoxin, an ability lacking in the most intensively studied pathway of C. acetobutylicum. The impact of such enzymes, and of the second rate limiting one (3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase), in butan-1-ol-forming recombinant strains is discussed. Successively, the enzyme encoding genes were assembled in a synthetic operon in order to create an artificial metabolic pathway module, which was expressed from a single plasmid and enabled the formation of the predicted product, butyrate. Two different butyrate metabolic pathway modules, pASG.wt_BUTD and pASG.wt_BUTAC, were constructed, which contained the butyrate fermentation genes (thia1, hbd, crt2, pbt and buk) from C. difficile, but differed in the origin of the butyryl-CoA dehydrogenase/ETF complex genes. These genes were either from C. difficile (pASG.wt_BUTD) or C. acetobutylicum (pASG.wt_BUTAC). The recombinant butyrogenic pathways were analyzed in vivo by a combination of enzymes activity measurements in cell free extracts and analysis of the fermentation process: substrate uptake, biomass-, product- and by-product- formations were established in order to understand the mass flows in the process. Only the recombinant strains were capable to produce butyrate with a maximum concentration of 3.1 and 3.7 mM, respectively. While growth characteristics, substrate consumption and product yields were rather similar in the recombinant strains, the butyryl-CoA dehydrogenase of different origin and sub-class caused remarkable different kinetics of butyrate formation, which are discussed with regard to their potential applications in solventogenis.


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