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Titel: Functional characterization of ATP-dependent chromatin remodelers of the CHD family of Drosophila
Autor: Murawska, Magdalena
Weitere Beteiligte: Brehm, Alexander (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0570
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0570
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-05705
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Funktionelle Charakterisierung der ATP-abhängigen Chromatin Remodeler der CHD Familie von Drosophila

Dokument

Schlagwörter:
Drosophila, Drosophila, Chromatin, Transkription, Chromatin, Transcription
Referenziert von:

Summary:
Members of the CHD family (Chromodomain-Helicase-DNA binding) of ATP-dependent chromatin remodelers play key roles at different steps of the transcription cycle. They are essential in regulation of developmental and differentiation programs in multicellular organisms. However, the complexity of these remodelers makes it difficult to study them in higher eukaryotes. In this study, advantage was taken of Drosophila melanogaster as a model organism, which possesses only four CHD family members. In the first part of this study, a novel chromatin remodeler, dCHD3, has been characterized biochemically and functionally. dCHD3 is highly similar to dMi-2 and consequently it possesses similar enzymatic activities in vitro. dCHD3 is a highly active, nucleosome stimulated ATP-dependent chromatin remodeler which slides mononucleosomes in vitro. The chromodomains of dCHD3 seem to be important for substrate recognition and for the remodeling activity of this enzyme. Despite the similarities, dCHD3 and dMi-2 differ significantly in other aspects. In contrast to dMi-2, dCHD3 exists as a monomer in vivo and it is not associated with deacetylase activity. Moreover, dCHD3 expression is restricted to early developmental stages and certain tissues. Finally, dCHD3 cannot compensate for the loss of dMi-2 which suggests that they are not functionally redundant. In the second part of this work, a role of dMi-2 in active transcription has been studied. dMi-2 has been implicated in transcriptional repression as a part of dNuRD or dMec complexes. This study shows that dMi-2 colocalizes with active regions on polytene chromosomes and it is recruited to heat shock genes. Both, reduction of dMi-2 expression in flies or ectopic expression of a catalytically inactive mutant, impair heat shock gene response. Interestingly, 3’ end processing and splicing of some of these genes is affected. In agreement with this, dMi-2 binds to nascent hsp gene transcripts upon heat shock induction. Consequently, these results suggest a role of dMi-2 catalytic activity in co-transcriptional RNA processing. Study of the recruitment mechanism of dMi-2 to heat shock genes suggests that it occurs in a poly(ADP-ribose) dependent manner. Several results support this hypothesis. First, dMi-2 recruitment to hsp70 gene is reduced upon PARP inhibition. Second, dMi-2 binds PAR polymers directly in vitro and several dMi-2 regions, which bind PAR independently in vitro, have been identified. Third, a dMi-2 mutant unable to bind PAR does not localise to active heat shock loci in vivo. Moreover, RNA and PAR compete for dMi-2 binding in vitro suggesting a two-step process for dMi-2 association with active heat shock genes. First, dMi-2 is recruited to the locus via PAR binding followed by association with nascent RNA transcripts. Collectively, these studies suggest, that stress-induced chromatin modification by PARP serves as a scaffold for rapid recruitment of factors that are required for quick and efficient transcriptional response.

Zusammenfassung:
Mitglieder der CHD Familie (Chromodomain-Helicase-DNA binding) chromatin-modifizierender Proteine spielen eine zentrale Rolle in unterschiedlichen Schritten des Transkriptionszyklus. Sie sind für die Regulation von Entwicklungs- und Differenzierungsprogrammen in mehrzelligen Organismen essentiell. Die Komplexität dieser Proteine erschwert allerdings ihre genauere Untersuchung in höheren Eukaryoten. In der vorliegenden Arbeit wurde daher auf den Modellorganismus Drosophila melanogaster zurückgegriffen, der lediglich über vier Mitglieder der CHD Familie verfügt. Im ersten Teil der Arbeit wurde dCHD3, ein neuentdecktes Mitglied der CHD Familie, biochemisch und funktionell charakterisiert. dCHD3 ist dMi-2, einem anderen CHD Familienmitglied, sehr ähnlich und besitzt folglich ähnliche enzymatische Aktivitäten in vitro. dCHD3 ist ein hochgradig aktives, durch Nukleosomen stimuliertes ATP-abhängiges Chromatin-modifizeirendes Enzym, das Mononukleosomen in vitro verschiebt. Die Chromo-Domänen von dCHD3 scheinen für Substraterkennung und die Aktivität dieses Enzyms wichtig zu sein. Trotz der Ähnlichkeiten in diesen Belangen, unterscheiden sich dCHD3 und dMi-2 in anderer Hinsicht deutlich. Im Gegensatz zu dMi-2 liegt dCHD3 in vivo als Monomer vor und ist mit keiner Deazetylierungsaktivität assoziiert. Darüberhinaus ist die Expression von dCHD3 auf frühe Entwicklungsstadien und bestimmte Gewebe beschränkt. dCHD3 ist zudem nicht in der Lage, einen Verlust von dMi-2 zu kompensieren, was dafür spricht, dass beide Proteine funktionell nicht redundant sind. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Beteiligung von dMi-2 in aktiver Transkription untersucht. dMi-2 spielt als Bestandteil der dNuRD und dMec-Komplexe bekanntermaßen bei der transkriptionellen Repression von Genen eine Rolle. Diese Arbeit zeigt hingegen, dass dMi-2 mit transkriptionell-aktiven Bereichen auf Polytänchromosomen kolokalisiert und zu Hitzeschock-Genen rekrutiert wird. Sowohl die Verringerung der Expression von dMi-2 als auch Überexpression einer katalytisch-inaktiven Mutante verringern die Hitzeschockantwort in Fliegen. Interessanterweise ist bei einigen dieser Gene die 3‘-Prozessierung und das Spleissen beeinträchtigt. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen bindet dMi-2 im Verlauf der Hitzeschockinduktion an hsp Transkripte, die im Entstehen begriffen sind. Insgesamt deuten diese Resultate auf eine Funktion von dMi-2 bei der kotranskriptionellen RNA-Prozessierung hin. Die Untersuchung der Rekrutierung von dMi-2 zu Hitzeschock-Genen deutet darauf hin, dass sie in einer Poly-(ADP-Ribose)-abhängigen Weise stattfindet. Mehrere Ergebnisse unterstützen diese Hypothese. Erstens ist die Rekrutierung von dMi-2 zum hsp70 Gen verringert, wenn PARP inhibiert wird. Zweitens bindet dMi-2 PAR Polymere in vitro und mehrere Regionen, die PAR in vitro unabhängig binden, wurden identifiziert. Drittens ist eine dMi-2 Mutante, deren PAR-Binderegionen entfernt wurden, nicht in der Lage, in vivo zu aktiven Hitzeschockloci zu lokalisieren. Weiterhin konkurrieren RNA und PAR um Bindung an dMi-2. Insgesamt deuten die Ergebnisse auf einen zweischrittigen Mechanismus hin, der zur Assoziierung von dMi-2 mit aktiven Hitzeschock-Genen führt. Zuerst wird dMi-2 mittels Bindung an PAR zum Locus rekrutiert, bindet daraufhin aber an neuentstandene Transkripte. Insgesamt deuten die vorliegenden Ergebnisse daraufhin, dass die stress-induzierte Modifikation von Chromatin durch PARP als Gerüst für die Rekrutierung von Faktoren dient, die ihrerseits für eine schnelle und effiziente transkriptionelle Antwort notwendig sind.


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