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Titel: Untersuchung zur Etablierung einer Real-time-PCR zum schnellen Screening auf Clostridium difficile aus Patienten- und Umgebungsproben
Autor: Albrecht, Ulla Maria
Weitere Beteiligte: Mutters, Reinier (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0569
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-05697
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0569
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Examination abeout developing a Real-time-PCR Assay for quick screening on Clostridium difficile in Patient- and environmental samples

Dokument

Schlagwörter:
Stuhlproben, Spore Contamination, Clostridium difficile, Patientenproben, Clostridium difficile Infection, Real-time-PCR, Umgebungsproben, Sporenbildner, Real time quantitative PCR, Spore, Clostridium-difficile-Infektion

Zusammenfassung:
Clostridium difficile ist der häufigste Erreger von Antibiotika-assoziierten Diarrhoen und hat in den letzten Jahren als nosokomialer Problemkeim stark an Bedeutung gewonnen. Das Bakterium ist grampositiv, stäbchenförmig, obligat anaerob und bildet Sporen aus. Bei einer Antibiotikatherapie wird die natürliche Darmflora gestört und Clostridium difficile kann sich leichter ansiedeln. Die Übertragung des Bakteriums erfolgt dabei in der Regel fäkal-oral über die Aufnahme von Sporen. Clostridium difficile kann drei bekannte Toxine ausbilden, Toxin A, Toxin B und das Binary-Toxin. Die Toxine verursachen schwere Diarrhoen bis hin zur pseudomembranösen Enterokolitis mit möglichem letalen Ausgang. Das Binary-Toxin wird nicht von allen pathogenen Stämmen gebildet, ist aber mit einer erhöhten Toxizität und Virulenz assoziiert. In den letzten Jahren sind weltweit gehäuft schwere Ausbrüche von Clostridium difficile assoziierten Diarrhoen dokumentiert worden, die mit dem neu aufgetretenen, Binary-Toxin bildenden Stamm Nap1/027 in Verbindung gebracht werden. Außerdem wurden vermehrt Clostridium difficile assoziierte Diarrhoen außerhalb von Kliniken in der Normalbevölkerung beschrieben. Da infizierte Patienten eine große Zahl von Sporen ausscheiden, die resistent gegen herkömmliche alkoholische Desinfektionsmittel sind, können sie in klinischen Einrichtungen lange überdauern und stellen eine gefährliche Infektionsquelle für andere Patienten und Mitarbeiter dar. Aus diesem Grund müssen strikte Hygieneregeln eingehalten werden, sobald ein Patient an Clostridium difficile assoziierter Diarrhoe erkrankt ist. Gleichzeitig kommt einer möglichst schnellen Diagnostik große Bedeutung zu damit zügig entsprechende Maßnahmen eingeleitet werden können. In dieser Arbeit wurde ein Real-time-PCR Assay zum Nachweis und zur Quantifizierung der 16S rRNA von Clostridium difficile weiteretabliert, wobei das Real-time-PCR Assay eine hohe Sensitivität und Spezifität erreichte. Mit Hilfe der Real-time-PCR wurde extrahierte DNA aus 242 Stuhlproben von zwei Patientengrupen des Klinikums Marburg untersucht. Die erste Patientengruppe umfasste Patienten deren Stuhlprobe zuvor im Toxinimmunoassay auf Toxin A und B von Clostridium difficile positiv getestet worden war. In der zweiten Patientengruppe waren Patienten eingeschlossen, die zwar an Diarrhoe erkrankt waren, deren Stuhlprobe aber im Toxinimmunoassay negativ getestet worden war. Es konnte gezeigt werden, dass das verwendete Real-time-PCR Assay eine schnelle, sensitive und spezifische Methode darstellt, um Clostridium difficile in extrahierter DNA aus Stuhlproben zu detektieren. Alle Stuhlproben wurden zur Kontrolle zusätzlich mit einer konventionellen PCR auf Toxin A, Toxin B und das Binary-Toxin untersucht. Bis auf wenige Ausnahmen bestätigte sich im Test auf Toxin A und B das Ergebnis des Toxinimmunoassays. Bei 10 Proben konnte zudem das Binarytoxin nachgewiesen werden, was dafür spricht, dass auch im Klinikum Marburg bereits neuere Stämme von Clostridium difficile Einzug gehalten haben. In verschiedenen Studien konnte belegt werden, dass die Umgebung von mit Clostridium difficile infizierten Patienten stark mit Sporen kontaminiert ist. Um besonders kontaminierte Bereiche aufzuzeigen und die Verbreitung der Sporen zu dokumentieren, wurde DNA aus 531 Abstrichen der Patientenumgebung extrahiert und mit dem weiteretablierten Real-time-PCR Assay untersucht. Dabei wurden Proben aus der Umgebung infizierter Patienten mit Proben der Umgebung nicht infizierter Patienten, die aber mit infizierten Patienten auf einer Station lagen und Proben von Stationen, auf denen seit 6 Monaten kein Fall von Clostridium difficile mehr aufgetreten war, verglichen. Es wurde deutlich, dass nicht nur die direkte Umgebung von mit Clostridium difficile infizierten Patienten stark kontaminiert ist, sondern auch der ganze Stationsbereich. Auch in den Abstrichproben der Stationen, auf denen seit 6 Monaten kein infizierter Patient mehr gelegen hatte, konnte Clostridium difficile nachgewiesen werden. In einer Korrelationsanalyse wurde zudem deutlich, dass vor allem die Hände des Personals eine Hauptinfektionsquelle darstellen. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die erforderlichen Hygienemaßnahmen auf den untersuchten Stationen gar nicht oder nur unzureichend eingehalten werden. Um zu vermeiden, dass sich Stämme wie der neu aufgetretene, hypervirulente Stamm Nap1/027 weiter ausbreiten, ist es daher nötig, dass sowohl den Patienten als auch dem Personal deutlich gemacht wird, dass strikt eingehaltene Hygienemaßnahmen die einzige effektive Möglichkeit darstellen weitere Infektionen zu verhindern. Aufgrund der Resistenz der Sporen gegen alkoholische Desinfektionsmittel kommt hier dem Händewaschen neben der normalen alkoholischen Desinfektion eine besondere Bedeutung zu

Summary:
Clostridium difficile is the leading cause of antibiotic associated diarrhoe. Over the last years clostridium difficile became more important because of the occurence of new more toxigenic and hyper virulent strains. Clostridium difficile is a gram positive, anaerobe, rod-shaped and spore-forming bacteria. In case of an antibiotic therapy the normal flora of the intestine is deranged and Clostridium difficile colonize the intestine. The main transmission of Clostridium difficile is faecal-oral. The bacteria formes three different toxines, toxin A, toxine B and the binary toxine. The binary toxine is often present in the new more toxigenic and hypervirulent strains, for example in the strain Nap1/027. Infected patients excret a lot of spores that persist for months in a clinical environment if they are not eliminated by spore-effective desinfection. The spores can be the origin of the infection of other patients. For this reason, a quick and sensitive diagnostic tool to detect Clostridium difficile is necessary in order to take measures against the spreading of spores. In this study at first a Real-time PCR Assay for detecting the 16S rRNA of Clostridium difficile was established. After that, 242 faecal samples from two patient-groups were tested by the Real-time PCR Assay detecting the 16SrRNA of Clostridium difficile. The first group contains faecal samples, which were tested positive in an toxinimmunoassay, detecting toxine A and B. The second group contains faecal samples which were tested negative in an ELISA test detecting toxine A and B. The Real-time PCR Assay reached high levels of sensitivity and specificity and it was shown that the Real-time PCR Assay was a quick and reliable method to detect the 16 SrRNA of Clostridium difficile in faecal samples. All samples were also tested by a conventional PCR Assay detecting toxine A, B and the binary toxine. In most cases the result of the conventional PCR Assay detecting toxine A and B confirms the result of the toxinimmunoassay. In ten samples the binary toxine was detected which shows that there are new strains of Clostridium difficile also at the university clinic of Marburg. In a second study 531 hospital environmental samples werte examined by the Real-time PCR assay detecting the 16 S rRNA of Clostridium difficile. A first group contains samples from the environment of patients infected by Clostridium difficile, a second group contains patients not infected with Clostridium difficile but present at the same ward as the infected patient. A third group contains samples from wards without the detection of Clostridium difficile within the last six months. The study revealed that not only the direct surrounding of an infected patient is contaminated by the spores of Clostridium difficile but the entire ward. In a correlation-analysis it became evident that the hands of the staff are the predominant way of transmission of spores of Clostridium difficile. Thus it is evident that the most important way to prevent the transmission of Clostridium difficile are hand-hygiene and desinfection activities.


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