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Titel: Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide mediates differential signaling through PAC1 receptor splice variants and activates non-canonical cAMP dependent gene induction in the nervous system - Implications for homeostatic stress-responding
Autor: Holighaus, Yvonne
Weitere Beteiligte: Weihe, Eberhard (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0551
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0551
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-05513
DDC: Naturwissenschaften
Titel(trans.): Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide aktiviert differenzielle Signaltransduktion via PAC1-Rezeptor-Splice-Varianten und nicht-kanonische cAMP-abhängige Geninduktion im Nervensystem - Implikationen für homöostatische Stressantworten

Dokument

Schlagwörter:
Neuropeptide, Neuropharmakologie, Genexpression, stress, neuropharmacology, PACAP, signal transduction, Stress, Signaltransduktion, neuropeptides, nervous system, Nervensystem, G protein-coupled receptors, G-Protein gekoppelte Rezeptoren, gene expression, PACAP

Summary:
Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)-mediated activation of its G protein-coupled receptor PAC1 results in activation of the two G proteins Gs and Gq to alter second messenger generation and gene transcription in the nervous system, important for homeostatic responses to stress and injury. PAC1 occurs in different splice variants of the third intracellular loop, designated PAC1null, hop or hip, affecting second messenger generation as shown in non-neural cells. At the splanchnico-adrenomedullary synapse, PACAP is required for prolonged catecholamine secretion from chromaffin cells to restore homeostasis during prolonged periods of stress. In the central nervous system, PACAP is neuroprotective in neurodegenerative conditions associated with e.g., stroke. In the present study, PAC1 splice variant-specific second messenger production and activation of homeostatic responses were investigated in neuroendocrine and neural cells. Heterologous expression of the major PAC1 splice variant of adrenomedullary chromaffin cells, PAC1hop, in PC12-G cells reconstituted a PACAP-mediated Ca2+ and prolonged secretory response similar to the one observed in primary chromaffin cells. The Ca2+ response mediated by PAC1null was somewhat smaller and PAC1hip failed to couple to Ca2+. Neither variant conferred prolonged catecholamine release, suggesting that expression of the hop cassette in the third intracellular loop of the receptor is required for sustained catecholamine release from neuroendocrine cells. In NG108-15 cells, heterologous expression of the PAC1hop, null and hip receptor conferred PACAP-mediated intracellular cAMP generation, while elevation of [Ca2+]i occurred efficiently in PAC1hop- and to a lesser extent in PAC1null-expressing cells. Expression of PAC1hip did not confer an intracellular Ca2+ response, indicating that PAC1hop is the receptor variant most efficiently coupled to combinatorial signaling through cAMP and Ca2+. PAC1hop-mediated signaling activated the mitogen-activated protein kinases (MAPK) extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2). Signaling to ERK proceeded through cAMP independently of the cAMP dependent protein kinase (PKA). PACAP induced transcription of the gene encoding the putative neuroprotectant stanniocalcin 1 (STC1), which has previously been implicated in neuronal resistance to hypoxic/ ischemic insult; gene induction proceeded through ERK but not PKA. Cyclic AMP generation by forskolin did not activate ERK in NG108-15 cells, but rather induced STC1 mRNA elevation through the canonical PKA dependent pathway. This suggests that activation of non-canonical cAMP signaling, mediating ERK-dependent gene induction, requires additional signaling through Ca2+ via PAC1hop in these cells. Primary rat cortical neurons expressed predominantly the PAC1hop and null variants. Exposure of cortical neurons to PACAP resulted in elevation of the two second messengers cAMP and Ca2+, activation of ERK1/2, and induction of STC1 gene transcription. PACAP-mediated ERK activation proceeded through cAMP but not PKA, and STC1 was induced via ERK but not PKA. Pharmacological stimulation of adenylate cyclases by forskolin also resulted in increased ERK phosphorylation and STC1 mRNA elevation independently of PKA. These results indicate that cAMP production alone is sufficient to activate ERK in differentiated cortical neurons, unlike in the less differentiated NG108-15 cell line. Induction of another PACAP target gene, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), occurred through the canonical cAMP/PKA pathway. PACAP has been shown by our laboratory and others to be neuroprotective against ischemia in rodent stroke models. To begin to define the mechanism of this neuroprotection, we employed two cell culture stroke models. Rat cortical neurons subjected to either oxygen-glucose-deprivation or glutamate-induced excitotoxicity underwent cell death as expected. However, treatment with PACAP did not increase neuronal survival in either of the two models, and STC1 over-expression also failed to increase resistance to neuronal cell death during glutamate-induced excitotoxicity. These data suggest that the protective effects of the neurotrophic peptide PACAP and the putative neuroprotectant STC1 during neurodegenerative conditions in vivo are mediated through cells absent in cultures of cortical neurons, such as glial cells. In conclusion, the present study has demonstrated that expression of different PAC1 splice variants determines the degree of activation of two different second messenger pathways that may mediate different functional outcomes during stress-responding. PACAP mediates ERK activation and STC1 induction via non-canonical cAMP signaling. The selective pharmacological activation of this potentially neuroprotective pathway, which is different from the cAMP/PKA pathway critical for learning and memory, could have therapeutic implications for neuroprotection in vivo.

Zusammenfassung:
Aktivierung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors PAC1 durch PACAP resultiert in Aktivierung von Gs und Gq und führt über Second Messenger-Produktion zur Aktivierung von Gentranskription, die essentiell für die homöostatische Stressantwort zu sein scheint. Durch differenzielles Splicing der dritten intrazellulären Schleife von PAC1 entstehen sogenannte PAC1null-, hop- und hip-Rezeptoren. In non-neuralen Zellen beeinflusst die Expression verschiedener Rezeptor-Varianten die Second Messenger-Generation. Als Kotransmitter an der splanchnico-adrenomedullären Synapse ist PACAP für anhaltende Katecholamin-Freisetzung von chromaffinen Zellen unentbehrlich, welche zur Wiederherstellung der Homöostase während anhaltendem Stress dient. Im zentralen Nervensystem ist PACAP neuroprotektiv in Assoziation mit z.B. Schlaganfall. In der vorliegenden Arbeit wurde die Produktion von Second Messengern durch verschiedene PAC1-Splice-Varianten und die Aktivierung homöostatischer Antworten in neuroendokrinen und neuralen Zellen untersucht. Heterologe Expression von PAC1hop, der Haupt-Variante chromaffiner Zellen, in PC12 Zellen, resultierte in einer PACAP-evozierten Ca2+- und anhaltenden sekretorischen Antwort, ähnlich der in primären chromaffinen Zellen. Auch die Aktivierung von PAC1null, jedoch nicht von PAC1hip, vermittelte eine intrazelluläre Ca2+-Antwort; diese war etwas geringer als die durch PAC1hop vermittelte. Weder PAC1null- noch PAC1hip-Aktivierung resultierte in anhaltender Katecholamin-Freisetzung. Dies zeigt die Notwendigkeit der Expression der hop-Kassette für anhaltende Freisetzung von Katecholaminen aus neuroendokrinen Zellen. Heterologe Expression von PAC1hop, null und hip in NG108-15 Zellen resultierte in PACAP-aktivierter cAMP-Produktion, während eine intrazelluläre Ca2+-Antwort nur durch PAC1hop und etwas geringer durch PAC1null vermittelt wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Signalkopplung an Ca2+ durch Expression der hop-Kassette erhöht und durch Expression der hip-Kassette aufgehoben wird; eine effiziente duale Signaltransduktion durch cAMP und Ca2+ wird also nur durch die PAC1hop-Variante vermittelt. Diese resultierte in einer Aktivierung der MAP Kinasen ERK1/2. Zyklisches AMP, jedoch nicht die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) waren in die Aktivierung von ERK involviert. PACAP induzierte das putativ neuroprotektive Gen Stanniocalcin 1 (STC1), welches laut Literaturstand neuronale Resistenz bei ischämischem Insult vermittelt; die Genaktivierung erfolgte via ERK, unabhängig von PKA. Direkte Stimulation von Adenylatzyklasen durch Forskolin hingegen löste keine ERK-Aktivierung aus und STC1-Induktion wurde durch kanonische (PKA-abhängige) Signaltransduktion vermittelt. In NG108-15 Zellen scheinen also zur Aktivierung von nicht-kanonischer cAMP-abhängiger Signaltransduktion, welche ERK-abhängige Geninduktion vermittelt, zusätzlich PAC1hop-aktivierte Ca2+-Signalwege nötig zu sein. Primäre kortikale Neuronen exprimierten hauptsächlich die PAC1hop- und PAC1null-Varianten. PACAP-Behandlung resultierte in einer intrazellulären Erhöhung von cAMP und Ca2+, ERK-Aktivierung und STC1-Induktion. Die ERK-Aktivierung war cAMP-abhängig und PKA-unabhängig. STC1-Induktion wurde durch ERK und nicht durch PKA vermittelt. Forskolin-Behandlung resultierte ebenso in PKA-unabhängiger ERK-Aktivierung sowie STC1-Induktion. Dies zeigt, dass in differenzierten kortikalen Neuronen gesteigerte cAMP-Produktion zur ERK-Aktivierung ausreicht. PACAP-vermittelte BDNF-Geninduktion hingegen war PKA-abhängig. Im Tiermodell konnte gezeigt werden, dass PACAP im Zusammenhang mit Schlaganfall neuroprotektiv ist. Um erste Einsichten in den Mechanismus dieser Neuroprotektion zu bekommen, wurden zwei Zellkultur-Modelle für Schlaganfall angewandt. Sauerstoff-Glukose-Deprivation und Glutamat-induzierte Excitotoxizität lösten, wie erwartet, in kortikaler Neuronenkultur Zelltod aus, der sich jedoch als PACAP-resistent herausstellte. Auch durch STC1-Überexpression konnte der durch Excitotoxizität ausgelöste Zelltod nicht reduziert werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die neuroprotektiven Effekte von PACAP und STC1 während neurodegenerativen Erkrankungen durch Zellen vermittelt werden, die in kortikaler Neuronenkultur fehlten, wie z.B. Gliazellen. Insgesamt weisen die Befunde dieser Arbeit darauf hin, dass die Expression verschiedener PAC1-Varianten den Aktivierungsgrad zweier Second Messengers bedingt und damit den funktionellen Ausgang nach Stress-Einwirkung bestimmt. PACAP-vermittelte ERK-Aktivierung und STC1-Induktion via nicht kanonischer cAMP-abhängiger Signaltransduktion unterscheidet sich von der kanonischen PKA-vermittelten Signaltransduktion, welche in physiologischen Prozessen wie Gedächtniskonsolidierung von Bedeutung ist. Die selektive pharmakologische Aktivierung dieses potenziell neuroprotektiven nicht-kanonischen Signalweges hat therapeutische Implikation für Neuroprotektion in vivo.


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