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Zusammenfassung:
Bei den STAT-Proteinen handelt es sich um eine evolutionär hochkonservierte Proteinfamilie, die aus sechs funktionellen Domänen aufgebaut ist. Obgleich die Linker-Domäne, die zwischen der aminoterminal davon gelegenen DNA-Binde- und der carboxyterminal positionierten SH2-Domäne lokalisiert ist, einen zentralen Bereich in der modularen Molekülorganisation beansprucht, ist über deren physiologische Bedeutung bislang vergleichsweise wenig bekannt. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Linker-Domäne von STAT1 einen Einfluss auf DNA-Bindung und transkriptionelle Aktivität besitzt; jedoch konnte der molekulare Mechanismus dafür nicht identifiziert werden. Um einen besseren Einblick in die Rolle der Linker-Domäne im Zusammenhang von DNA-Bindung und Zielgenerkennung zu gewinnen, wurden Punktmutanten einzelner konservierter Aminosäurereste des STAT1-Moleküls generiert und diese funktionell charakterisiert. Die Substitutionsmutation eines konservierten Glutamatrests in Position 500 führte zu einer verbesserten transkriptionellen Aktivität nach IFN-Stimulation, während sich Phosphorylierungs- und Kernakkumulationskinetik sowie DNA-Bindeaffinität nicht vom Wildtyp-Molekül unterschieden. Die IFN-abhängige Zielgenaktivierung war im Gegensatz zur IFN-vermittelten Signalantwort jedoch supprimiert. Dieses zeigt, dass die Linker-Domäne ursächlich an einer differentiellen, ligandenabhängigen Gen-aktivierung beteiligt ist. Des Weiteren konnte eine Beteiligung der Linker-Domäne an der Dephosphorylierung von STAT1 nachgewiesen werden. Die Mutation eines hochkonservierten Lysinrests in Position 525 führte zum Verlust einer für die Stabilisierung der parallelen Dimerkonformation essentiellen Salzbrücke mit einem kritischen Glutamatrest der SH2-Domäne des gleichen Monomers. Dieser Stabilitätsverlust scheint das Gleichgewicht der Konformere im STAT1-Dimer zugunsten der antiparallelen Dimerkonformation zu verschieben, wobei die anti-parallele Konformation von der STAT1-inaktivierenden Phosphatase bevorzugt wird. Durch Dephosphorylierungsassays konnte gezeigt werden, dass die K525A-Mutante gegenüber dem Wildtyp-Protein ein bevorzugtes Substrat der nukleären T-Zell-Phosphatase ist. Dies resultiert nach Stimulation mit IFN in einer erhöhten In-vivo- und In-vitro-Dephosphorylierungsrate, verminderten Tyrosin-Phosphorylierung, reduzierten Kernakkumulation und einer konsekutiv verminderten Genaktivierung in vivo. Um einen besseren Einblick in die DNA-Bindung von STAT1 zu gewinnen, wurde zusätzlich eine weitere Mutante der DNA-Bindedomäne charakterisiert, die im Gegensatz zu anderen DNA-Bindemutanten nicht in direktem Kontakt mit der DNA-Helix steht, aber in ihrer Affinität zur DNA inhibiert ist. Wie mit Hilfe dieser Struktur-mutante gezeigt werden konnte, haben nicht nur Aminosäuren, die in direktem Kontakt mit der DNA stehen einen Einfluss auf die DNA-Bindung, sondern auch solche, die an der Bildung der dreidimensionalen Domänenstruktur beteiligt sind.

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