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Titel: Vergleichende Analysen der nukleär/zytoplasmatischen Exporteigenschaften von SR-ähnlichen Proteinen und ihre regulatorische Funktion im mRNA Spleißing-Prozess
Autor: Hackmann, Alexandra
Weitere Beteiligte: Krebber, Heike (Prof.)
Erscheinungsjahr: 2012
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0456
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0456
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-04561
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Comparative analysis of the nuclear/cytoplasmic export requirements of SR-like proteins and their regulatory function in mRNA splicing process

Dokument

Schlagwörter:
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae, Gbp2, Intracellular transport, RNS-Spleißen, Messenger-RNP, Intrazellulärer Transport, Npl3, Gbp2, messenger-RNP, Messenger-RNP, Kernporen-Komplex, Npl3

Zusammenfassung:
Eukaryontische Zellen zeichnen sich durch ihre Kompartimentierung in Zytoplasma und Zellkern aus, die eine regulierte Genexpression ermöglicht. Im Zellkern erfolgt die Transkription der Gene in prä-mRNAs, die nach extensiver Prozessierung zur Export kompetenten mRNA im Ribonukleoprotein-Komplex („messenger ribonucleoprotein particle“ = mRNP) heranreifen. Die SR-ähnlichen mRNA Bindeproteine Npl3p, Gbp2p und Hrb1p assoziieren während der Transkription mit der mRNA im Zellkern und Npl3p interagiert mit dem Export Rezeptor Mex67p-Mtr2p, der die Export-kompetente mRNA durch die Kernporen-Komplexe der Kernmembran in das Zytoplasma transportiert. Dort erfolgt an den Ribosomen die Proteintranslation anhand der mRNA kodierten genetischen Information. Npl3p ist in vielen Saccharomyces cerevisiae Stämmen ein essentielles Protein und Mutationen führen zu mRNA Export-Defekten. In einem weltweiten Deletionsprojekt wurde eine überlebensfähige NPL3-Deletion im Stammhintergund BY4741 hergestellt. Interessanterweise sind in npl3∆ keine signifikanten mRNA Export Defekte vorhanden, was auf eine weitere, bisher unbekannte Funktion von NPL3 hindeutet. In Lokalisationsstudien wurden jedoch nukleäre Export-Defekte der ribosomalen prä-60S, nicht aber der 40S Untereinheit in npl3∆-Zellen nachgewiesen. Npl3p interagiert physikalisch sowohl über das ribosomale Protein Rpl25p als auch über die 25S rRNA mit der prä-60S Untereinheit. Eine Funktion von Npl3p in der Prozessierung des ribosomalen Vorläufers ist aufgrund von nicht detektierten rRNA Prozessierungsdefekten und nukleolaren Mislokalisationen in npl3∆ unwahrscheinlich. Npl3p interagiert mit den Faktoren der Export kompetenten prä-60S Untereinheit Nmd3p und dem ebenfalls im prä-60S Export agierenden Export-Rezeptor Mex67p. Eine Deletion von NPL3 beeinflußt jedoch nicht die Rekrutierung dieser prä-60S Exportfaktoren zur ribosomalen Untereinheit. Da Npl3p die prä-60S Untereinheit physikalisch bindet und seine Deletion nukleäre Export-Defekte hervorruft, wirkt Npl3p als unabhängiger Exportadapter im prä-60S Transportprozess. Npl3p hat das Potential den Kontakt zwischen der prä-60S Untereinheit und den Kernporen-Komplexen über eine physikalische Interaktion mit dem Nup60p assoziierten Mlp1p zu vermitteln. In einem zweiten Kapitel dieser Arbeit erfolgte die vergleichende Analyse der Exporteigenschaften von Gbp2p, Hrb1p und Npl3, welche erstmalig eine Verbindung zum Spleißing-Prozess aufzeigt. In einem „Screen“ wurden die Spleißingfaktor-Mutanten prp8-908/988 und prp17-Q336* identifiziert, die starke nukleäre Export-Defekte von Gbp2p und Hrb1, nicht aber von Npl3p hervorrufen. GBP2 und HRB1 Deletionen interagieren genetisch mit diesen Spleißingfaktor-Mutanten der Spleißing Spätphase, während eine NPL3 Deletion weder genetisch noch physikalisch mit diesen Faktoren interagiert. Gbp2p und Hrb1p zeigen Protein-Protein Wechselwirkungen mit Prp17p und mit Prp43p des postspleißosomalen Komplexes. Die nukleären Mislokalisationen von Gbp2p und Hrb1p in Spleißing-faktor Mutanten der Spleißing Spätphase beruhen auf eine starke Störung der mRNA Bindung, die in RNA-Co IP Studien ermittelt wurden. Für Gbp2p und Hrb1p wurde in RIP-Chip und qRT-PCR-Studien eine präferentielle Bindung für mRNAs identifiziert, die Intronsequenzen enthalten. Marginale Spleißing Defekte, aber signifikante Proteinexpressionsabnahmen Intron-haltiger Gene wurden vor allem in der Doppel-Deletion gbp2∆ hrb1∆ nachgewiesen. Gbp2p und Hrb1p interagieren mit dem Export-Rezeptor Mex67p und sind somit als neue mRNA Export Adapter identifiziert worden. In Spleißingfaktor-Mutanten sind diese Adapter-Rezeptor Bindungen gestört, wodurch der Export von ungespleißten mRNAs vermutlich zurückgehalten wird. Gbp2p und Hrb1p zeigen eine Verbindung zum Kernporen-Komplex assoziierten Mlp1p. Dieser Faktor hat eine Funktion in der finalen Qualitätskontrolle von gespleißten mRNAs bevor diese den Zellkern verlassen können. Daraus ergibt sich folgendes Modell: Gbp2p und Hrb1p werden Spleißing-abhängig zur mRNA rekrutiert und unterstützen den Export von gespleißten mRNAs über eine Interaktion mit dem Export-Rezeptor Mex67p. Im Gegensatz dazu agiert Npl3p als universeller Export-Adapter, der unabhängig vom Intron-Status der mRNA Mex67p bindet. Bekannterweise wird Npl3p über die RNA Polymerase II frühzeitig auf alle mRNAs geladen, während Gbp2p und Hrb1p in der Elongations- phase zur mRNA gelangen. Eine stabile Assoziation von Gbp2p und Hrb1p mit der mRNA erfolgt erst durch die Assemblierung des Spleißosom, mit dessen Komponenten der Spleißing-Spätphase sie physikalisch interagieren. Diese Wechselwirkungen unterstützen Spleißing und ermöglichen über die sich anschließende Adapter-Rezeptor Interaktion einen effizienten und kontrollierten Export von gespleißten mRNAs.

Summary:
In eukaryotic cells the separation into a nuclear and cytoplasmic compartment leads to an advantage for regulation of an efficient gene expression. Gene expression starts in the nucleus with the transcription of DNA to premature mRNAs. These transcripts are extensively processed and mature to the export competent mRNA within the messenger ribonucleoprotein particle (mRNP). Three mRNA binding SR-like proteins Npl3p, Gbp2p, and Hrb1p are loaded co-transcriptionally onto the mRNA and Npl3p interacts with the export receptor Mex67p-Mtr2p which translocates the processed and export competent mRNA through the nuclear pore complex into the cytoplasm. Once in the cytoplasm the mRNA encoded genetic information is translated into protein at the ribosoms. In general, NPL3 is essential in most yeast strains and npl3 mutants lead to mRNA export defects. However, in a worldwide deletion project a viable npl3∆ strain was created in the BY4741 background. Interestingly, in npl3∆ no mRNA export defects were detected, suggesting a further yet unknown function for NPL3. However GFP-localization studies of representing reporter proteins revealed a nuclear export defect for the ribosomal pre-60S but not for the 40S subunit in npl3∆. Npl3p physically interacts with the ribosomal protein Rpl25p and binds to the 25S rRNA of the pre-60S subunit. Nevertheless export defects unlikely refer to preribosome processing defects as in npl3∆ a nucleolar mislocalization was not observed and rRNA processing defects were not detected. In fact, Npl3p physically interacts with pre-60S export adapter Nmd3p and the export receptor Mex67p which marks for the export competent pre-60S subunit. Npl3p is not acting as an adapter for these factors as npl3∆ does not influence the binding of these factors to the pre-60S subunit. Here, we propose a novel function for Npl3p as an independent adapter for the export of the pre-60S subunit as it interacts directly with the pre-60S subunit and a deletion of NPL3 leads to export defects of this ribosomal subunit in the nucleus. Furthermore Npl3p has the potential to mediate the contact of these macromolecules to the nuclear pore complex via an interaction with the nucleoporin Nup60p associated Mlp1p. The second part of this thesis leads to a characterization of the export requirements of Gbp2p, Hrb1p and Npl3p. For a first time a yet unknown link to late steps of the splicing process was observed for Gbp2p and Hrb1p but not for Npl3p. In a screen the splicing factor mutants prp8-908/988 and prp17-Q336* were identified, that lead to severe nuclear export defects for Gbp2p and Hrb1p but not for Npl3p. GBP2 and HRB1 deletion show genetic interactions with these splicing factor mutants in contrast to the deletion of NPL3 which showed neither physical nor genetic interactions. Gbp2p and Hrb1p interact with Prp17p and Prp43p, a factor of the postspliceosomal complex. The nuclear mislocalization of Gbp2p and Hrb1p are effect of substantially reduced mRNA binding levels in prp8-908/988, prp17∆ and prp43-S247A while the amount of bound mRNAs to Npl3p only little is affected. RIP-Chip and qRT-PCR analysis revealed a preference for Gbp2p and Hrb1p binding to mRNAs that contain introns. Especially the double deletion strain gbp2∆ hrb1∆ shows slight splicing defects and significant reduced protein expression levels of intron containing genes. Gbp2p and Hrb1p are novel identified mRNA export adapters for the interaction with the export receptor Mex67p. These adapter-receptor interactions are highly reduced in prp8-908/988 and prp17∆ that may deplete the export of unspliced mRNAs. Furthermore, Gbp2p and Hrb1p interact with the nuclear pore associated Mlp1p which performs a function in the quality control of spliced mRNAs before they leave into the cytoplasm and Gbp2p and Hrb1p may contribute to this final mRNA quality check at the nuclear pores. These findings lead to a following model: Gbp2p and Hrb1p in contrast to Npl3p are recruited to the mRNAs by the splicing machinery and the interaction of Gbp2p and Hrb1p with the export receptor Mex67p promotes the export of spliced mRNAs. Contrary, Npl3p is a general export adapter that interacts regardless of intron status with bulk mRNA and interacts with the mRNA export receptor Mex67p. It is well known that Npl3p is early recruited to the mRNA by action of RNA polymerase II while Gbp2p and Hrb1p are recruited to mRNA during transcription elongation. However, with the co-transcriptional association of the spliceosome, a direct interaction of Gbp2p and Hrb1p with splicing factors of the late splicing phase ascertains a strong binding to spliced mRNAs and allows for a recruitment of Mex67p molecules via physical interactions with Gbp2p and Hrb1p. In this way these factors promote an efficient and controlled transport of the spliced mRNAs into the cytoplasm.


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