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Titel: Der Einfluss von Pdcd4 auf die Expression des Proteins Angiopoietin2
Autor: Krug, Sebastian
Weitere Beteiligte: Lankat-Buttgereit, Brigitte (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0427
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0427
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-04274
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Knock-down of Pdcd4 Impairs Angiogenesis Via Up-regulation of Angiopoietin-2

Dokument

Schlagwörter:
Angiogenese, Angiogenese, Pdcd4, tumor suppressor, angiogenesis, Tumorsuppressor, Angiopoietin2, Tumorsuppressor, angiopoietin-2, Pdcd4, Angiopoietin2, Pdcd4

Zusammenfassung:
Pdcd4 (programmed cell death 4) ist ein neuer Tumorsuppressor. In vielen Tumoren oder während maligner Transformation ließen sich supprimierte Pdcd4 Mengen nachweisen. Hohe Pdcd4 Spiegel wiederum verhinderten eine neoplastische Umwandlung. Bislang schienen aber die Wirkungen von Pdcd4 abhängig vom Zelltyp zu sein. Ang2 (Angiopoietin2), ein Wachstumsfaktor, der an der Neubildung von Gefäßen beteiligt ist, könnte ein zelltypübergreifendes Zielgen von Pdcd4 darstellen. Eine gezielte Suppression von Pdcd4 mittels siRNA (siPdcd4) in verschiedenen Tumorzelllinien der Mamma, der Leber, des pankreatiko-gastro-intestinalen Traktes sowie in Endothelzellen bestätigte in Western Blots eine Steigerung von Ang2 Protein. Zusätzlich zeigte sich in semiquantitativen RT- und RTD-PCRs eine Regulierung auf transkriptionaler Ebene. Damit ist Ang2 tatsächlich ein in mehreren Tumorzelltypen reguliertes Zielgen von Pdcd4. Nachdem eine erhöhte Ang2 Proteinexpression unter Pdcd4 Suppression in Western Blot Untersuchungen belegt werden konnte, ließen sich auch in Mediumüberständen von stabil (shPdcd4) oder transient (siPdcd4) transfizierten Zelllinien erhöhte Ang2 Mengen im Vergleich zur Kontrolle nachweisen. Dies sprach für eine gesteigerte Sekretion von Ang2 Protein. Die funktionelle Bedeutung der erhöhten Ang2 Spiegel wurde in Tube Formation- und Boyden Chamber Assays untersucht und dabei die immortalisierte humane mikrovaskuläre endotheliale Zelllinie HMEC-1 verwendet. Die im konditionierten Medium von stabil shPdcd4 transfizierten BON-1- und HCT116-Zellen erhöhten Ang2 Spiegel führten in Tube Formation Assays, im Vergleich zum Kontrollmedium, zu einer gesteigerten Gefäßneubildung. Anhand von Verzweigungen und Länge der Tubes erfolgte eine Software-basierte Auswertung. Bestätigt wurden diese Ergebnisse in Tube Formation Assays mit rekombinanten Ang2. Dabei ließen sich im Einklang mit der bestehenden Literatur zwei Auswirkungen nachweisen. Zum einen zeigten sich proangiogenetische Effekte von Ang2 in Verbindung mit Medium mit 10% FBS, zum anderen gefäßregressive Wirkungen von Ang2 in Medium mit 1% FBS. Vermutlich liegt das an den unterschiedlichen VEGF Konzentrationen, die mit steigendem FBS Gehalt des Mediums auch zunehmen. Zusätzlich ließ sich die Fähigkeit von Ang2, Migration von endothelialen Zellen zu fördern, in Boyden Chamber Assays nachweisen. Hierbei zeigten die gesteigerten Ang2 Konzentrationen im konditionierten Medium der stabil transfizierten BON-1- und HCT116 Zellen mit 1% und 10% FBS promigratorische Effekte auf die HMEC-1 Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Ang2 in diversen Tumorzelllinien ein Zielgen des Tumorsuppressors Pdcd4 ist. Durch Verringerung von Pdcd4 mittels siRNA wurde Ang2 vermehrt transkribiert, translatiert und sezerniert. Die funktionelle Bedeutung der gesteigerten Ang2 Sekretion ließ sich in Tube Formation Assays (angiogenetische Wirkung) und Boyden Chamber Assays (promigratorische Wirkung) nachweisen. Mit der Steuerung von Ang2 durch Pdcd4 bindet sich der Tumorsuppressor direkt in die Neoangiogenese von Tumoren ein und unterstreicht damit seine Bedeutung in der Entwicklung maligner Neoplasien. Insgesamt gesehen ist eine Wiederherstellung der Pdcd4 Expression in Tumoren und die damit verbundene Überführung in die aktive Rolle als Tumorsuppressor ein Hauptanliegen möglicher therapeutischer Ansätze.

Summary:
Pdcd4 (programmed cell death 4) is a new tumour suppressor. Pdcd4 levels are reduced in various tumours and during malignant transformation. Furthermore, high amounts of Pdcd4 showed the potential to repress malignant transformation. So far, the effects of Pdcd4 seemed to be cell type specific. The growth factor Ang2 (Angiopoietin2), which is involved in angiogenesis, could be a cell type independent target gene of Pdcd4. Selective down-regulation of Pdcd4 by siRNA (siPdcd4) showed enhanced Ang2 levels in Western Blots of tumour cell-lines of the mammary, liver, pancreas, gastrointestinal tract and in endothelial cells. Additionally, semiquantitative RT- and RTD-PCRs indicated a transcriptional regulation. Therefore Ang2 represents a target gene of Pdcd4 in various tumour cell-lines. After proving the elevated Ang2 expression by Pdcd4 suppression in Western Blots, investigations of supernatants of stably (shPdcd4) and transiently (siPdcd4) transfected cell-lines revealed higher Ang2 amounts in comparison to the control, indicating an augmented secretion of Ang2 protein. Tube Formation- and Boyden Chamber Assays were done to show the relevance of high Ang2 levels. We used the immortalized microvascular endothelial cell-line HMEC-1 for these experiments. The higher Ang2 levels in the conditioned medium of stably shPdcd4 transfected BON-1- und HCT116- cells caused an increased angiogenic activity in Tube Formation Assays in comparison to the mock control. Length and junctions of the tubes were software based evaluated. Tube Formation Assays with recombinant Ang2 confirmed these results. According to the existing literature Ang2 acted in two ways. On the one hand Ang2 increased the angiogenic activity in medium with 10% FBS, on the other hand Ang2 repressed angiogenesis in medium with 1% FBS. The predictable reasons are the different VEGF amounts in Medium with 1% and 10% FBS. Next to angiogenesis Ang2 had migrational potential on HMEC-1 cells in Boyden Chamber Assays. The higher levels of Ang2 in the conditioned medium of stably shPdcd4 transfected BON-1- and HCT116 cells with 1% and 10% FBS caused an increased migration on HMEC-1 cells in comparison to the mock control. In summary, this study shows that Ang2 is a target gene of Pdcd4 regulated in various tumour cell-lines. The suppression of Pdcd4 by siRNA led to a higher transcription, translation and secretion of Ang2. The functional importance of increased Ang2 amounts was seen in Tube Formation and Boyden Chamber Assays. Pdcd4 controls angiogenesis via regulation of Ang2 and is thus involved in the development of malignant neoplasms. All in all, a putative restoring of Pdcd4 in tumours and with it an active role as a tumour suppressor could be a promising therapeutic target.


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