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Titel: Towards Improved Aldose Reductase Inhibitors - Structural and Thermodynamic Investigation of Mutant and Wild Type Aldose Reductase Inhibitor Complexes
Autor: Koch, Cornelia
Weitere Beteiligte: Klebe, Gerhard (Prof.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0416
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-04163
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0416
DDC: Chemie
Titel(trans.): Auf dem Weg zu verbesserten Aldosereduktaseinhibitoren - Strukturelle und thermodynamische Untersuchung von Wildtyp- und Mutantenkomplexen der Aldosereduktase

Dokument

Schlagwörter:
Kalorimetrie, Wirkstoffdesign, Wirkstoff-Rezeptor-Bindung, aldose reductase, diabetes, Inhibitor, Röntgenstrukturanalyse, Isothermal titration calorimetry, Diabetes mellitus, Isothermale Titrationskalorimetrie, drug design, Aldosereduktase, X-ray

Summary:
Rational drug design for flexible proteins like human aldose reductase comprises special challenges to find novel lead compounds or to improve known inhibitors. In this thesis, diverse aspects of the complexity of such a task were investigated to find promising new lead scaffolds and enhance the affinity of known aldose reductase inhibitors. Within different design cycles, the prediction of ligand binding modes in a binding pocket capable to adapt to a bound ligand is such a challenging task. A benzothiazole scaffold originating from a virtual screening run was kinetically and structurally evaluated. An unexpected binding mode in complex with wild-type aldose reductase and a new protein conformer provided the basis for a further drug design cycle to optimize the scaffold. The benzothiazole core was expanded to explicitly address an additional subpocket of the protein to enhance both affinity and selectivity over a closely related protein. Flexibility is a common feature of many proteins. For human aldose reductase, a variety of conformers are adopted with different inhibitors. In Chapter 3, the known inhibitors zopolrestat and IDD393 each in complex with a threonine 113 mutant and a benzothiazole inhibitor in complex with the wild type of aldose reductase were investigated with respect to the impact of inhibitor binding on protein conformation. Though the interaction to the mutated residue does not directly alter the binding mode of zopolrestat, a shift of its basic scaffold is induced and subsequently affects the interaction to a flexible loop and introduces disorder. With IDD393, two distinct binding site conformations resulting in different crystal forms can be directly compared. Improvements of the computational methods for affinity prediction from the structure of protein-ligand complexes requires a better understanding of the nature of molecular interactions and biomolecular recognition principles. In Chapter 4, the binding of two chemically closely related human aldose reductase inhibitors have been studied by high resolution X-ray analysis (0.92A-1.35A) and isothermal titration calorimetry against a series of single-site mutants of the wild-type protein. A crucial active site threonine, thought to be involved in a short bromine-to-oxygen halogen bond to the inhibitors in the wild type has been mutated to the structurally similar residues alanine, cysteine, serine, and valine. Overall, structurally the binding mode of the inhibitors is conserved; however, small but significant geometrical adaptations are observed as a consequence of the spatial and electronic changes at the mutation site. They involve the opening of a central bond angle and shifts in consequence of the lost or gained halogen bonds. Remarkably, the tiny structural changes are responded by partly strong modulation of the thermodynamic profiles. Even though the free energy of binding is maximally perturbed by only 7kJ/mol, much stronger modulations and shifts in the enthalpy and entropy signature are revealed which indicate a pronounced enthalpy/entropy compensation. However, facing these perturbances against the small structural changes, an explanatory correlation can be detected. This also provides deeper insights how single-site mutations can alter the selectivity profile of closely related ligands against a target protein. High resolution structural data of protein inhibitor complexes is the key to rational drug design. Synchrotron radiation allows for atomic resolution but is frequently accompanied by radiation damage to protein complexes. In Chapter 5, a human aldose reductase mutant complexed with a bromine substituted inhibitor was determined to atomic resolution. Though the radiation dose was moderate, a selective disruption of a bromine-inhibitor bond during the experiment was observed while the protein appears unaffected. A covalent bond to bromine is cleaved and the displaced atom is not scattered throughout the crystal but can most likely be assigned as a bromide ion to an additional difference electron density peak observed in the structure: The bromide relocates to an adjacent unoccupied site where promising interactions to protein residues stabilize its position. These findings were verified by a second similar structure determined with considerably higher radiation dose.

Zusammenfassung:
Rationales Wirkstoffdesign für flexible Proteine wie die humane Aldosereduktase ist mit verschiedenen Herausforderungen verbunden. Um neue Leitstrukturen zu finden und die Affinität bekannter Inhibitoren zu verbessern wurden innerhalb dieser Arbeit verschiedene Methoden angewendet, und dabei die unterschiedlichen Aspekte und deren Komplexität beleuchtet. Innerhalb aufeinanderfolgender Designzyklen ist die Voraussage von Bindungsmodi eines Liganden in einer anpassungsfähigen Bindetasche ein sehr komplexes Problem. Ein Benzothiazepin, das in einem vorhergehenden virtuellen Screening gefunden worden war, wurde kinetisch und strukturell im Komplex mit Aldosereduktase charakterisiert. Der dabei beobachtete, unerwartete Bindungsmodus mit einem neuen, bisher unbekanntem Proteinkonformer stellte die Basis für einen weiteren Designzyklus dar. Um das Grundgerüst zu optimieren, wurden Substituenten eingeführt, die eine Subtasche des Proteins direkt adressieren und neben der Affinität auch die Selektivität des Liganden gegenüber einem nahe verwandten Protein erhöhen sollten. Proteinflexibilität ist eine verbreitete Eigenschaft in Proteinen verschiedenster Funktionalität. Von Aldosereduktase sind eine Reihe unterschiedlicher Konformere bekannt, die im Komplex mit verschiedenen Bindungspartnern eingenommen werden. In einem Teil der Arbeit wurde der Einfluss von Inhibitoren auf die Ausbildung der verschiedenen Bindetaschenkonformere anhand von Zopolrestat und IDD393 im Komplex mit einer Threonin-113-Mutante sowie einem Benzothiazepin-Inhibitor im Komplex mit der Wildtypvariante von Aldosereduktase untersucht. Obwohl die direkte Interaktion zwischen Zopolrestat und der mutierten Aminosäure den Bindungsmodus nicht verändert, bewirkt sie eine Verschiebung des Inhibitorgrundgerüstes. Dies beeinflusst die Wechselwirkung mit einem benachbarten, beweglichen Loop, wodurch dieser weniger fixiert ist und Unordnung erfährt. Im Komplex mit IDD393 konnten zwei abweichende Bindetaschenkonformationen gefunden werden. Diese führten zu unterschiedlichen Kristallformen und konnten direkt miteinander verglichen werden: Die Verbesserung computergestützter Methoden zur Affinitätsvorhersage aus Protein-Ligand-Komplexen verlangt nach einem detaillierten Wissen um die Natur molekularer Wechselwirkungen und biomolekularer Erkennungsprinzipien. Kapitel 4 beschäftigt sich mit der Bindung zweier chemisch sehr ähnlicher Aldosereduktaseinhibitoren. Hochaufgelöste Röntgenstrukturen (0,92 - 1,35A) und kalorimetrische Bindungsdaten dieser Inhibitoren im Komplex mit einer Serie von Bindetaschenmutanten der Aldosereduktase wurden analysiert. Ein entscheidendes Threonin, das vermutlich an einem kurzen Brom-Sauerstoff-Kontakt, einer sogenannten Halogenbindung, beteiligt ist, wurde durch die strukturell ähnlichen Aminosäuren Alanin, Cystein, Serin und Valin ausgetauscht. Während sich der Bindungsmodus, oberflächlich betrachtet, nicht verändert, sind kleinste, aber signifikante geometrische Anpassungen erkennbar, die das Resultat der räumlichen und elektrostatischen Veränderungen durch die Mutation sind. Dazu gehören die Aufweitung eines zentralen Bindungswinkels im Inhibitor sowie die Verschiebung des Inhibitorgerüstes durch den Verlust oder die verstärkte Halogenbindung. Bemerkenswert ist die Übertragung dieser kleinen geometrischen Änderungen in starke Änderungen der thermodynamischen Bindungsprofile. Obwohl die freie Bindungsenergie sich insgesamt um nur etwa 7 kJ/mol ändert, lassen sich deutlich stärkere Anpassungen in den enthalpischen und entropischen Bindungsbeiträgen erfassen. Eine ausgeprägte Enthalpie-Entropie-Kompensation wird deshalb vermutet. Diese Effekte lassen sich durch die strukturellen Änderungen erklären. Diese Erkenntnisse liefern Hinweise, wie Mutationen das Selektivitätsprofil von chemisch ähnlichen Liganden beeinflussen können. Hochaufgelöste strukturelle Daten von Protein-Inhibitor-Komplexen bilden die Basis für wissensbasiertes Wirkstoffdesign. Die Verwendung von Synchrotronstrahlung ermöglicht atomare Auflösungen solcher Komplexstrukturen, ist allerdings mit der Gefahr von Strahlungsschäden an Protein oder Inhibitor verbunden. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Struktur eines bromsubstituierten Inhibitors im Komplex mit einer Aldosereduktase-Mutante mit atomarer Auflösung bestimmt. Obwohl eine moderate Strahlungsdosis während des Experiments vorlag und kein Einfluss auf Proteinreste zu erkennen war, wurde der Bromsubstituent selektiv abgespalten. Die kovalente Bindung zum Brom wurde zerstört, wobei das abgespaltene Atom wider Erwarten wahrscheinlich als Bromid einem zusätzlichen Elektronendichtepeak zugeordnet werden konnte: Das Bromid nimmt eine neue Position in der Nähe ein, die durch vielversprechende Interaktionen mit benachbarten Aminosäuren stabilisiert wird.


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