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Titel: Quantification of the in-vivo affinity of PI(4,5)P2 effectors and sensors with the phosphoinositide phosphatase Ci-VSP
Autor: Rjasanow, Alexandra
Weitere Beteiligte: Oliver, Dominik (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0371
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-03714
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0371
DDC: Naturwissenschaften
Titel(trans.): Quantifizierung der in-vivo Affinität von PI(4,5)P2-Effektoren und Sensoren mit der Phosphoinositidphosphatase Ci-VSP

Dokument

Schlagwörter:
Kir, Rapamycin, Spannungsk, KCNQ, Kir, HCN-Kanal, Phosphate, Ionenkanal, Ci-VSP, tubby, Phosphatidylinositphosphatkinase <1-Phosphatidylinosit-4-Phosphatkinase>

Summary:
Zusammenfassung Quantifizierung der in-vivo Affinität von PI(4,5)P2- Effektoren und Sensoren mit der Phosphoinositidphosphatase Ci-VSP Phosphoinositide (PI) sind Mitglieder einer Familie kleiner Membranphospholipide, die wichtige Aufgaben in vielen eukaryotischen Signaltransduktionswegen übernehmen. Das PI Phosphoinositid(4,5)biphosphat (PI(4,5)P2) z.B. ist vorwiegend in Plasmamembranen lokalisiert und reguliert viele zelluläre Funktionen, wie z.B. die Aktivierung von Proteinen (z.B. Ionenkanäle). In Anbetracht der Vielfalt zellulärer PI(4,5)P2 abhängiger Funktionen ist es unklar, wie eine Spezifität dieser Signalwege erzielt werden kann, so dass z.B. nur ein Teil potentieller Effektorproteine auf eine gegebene PI(4,5)P2 Konzentrationsänderung antwortet. Ein wichtiger Faktor, der die Spezifität der PI(4,5)P2-Signalwege in Bezug auf die verschiedenen Zielproteine bestimmt, ist die PI(4,5)P2-Affinität dieser Effektoren. Um den Einfluss dynamischer PI(4,5)P2 Konzentrationsänderungen auf Effektorproteine zu verstehen, ist es notwendig die PI(4,5)P2-Affinitäten dieser Proteine zu kennen. Jedoch fehlte den bisherigen Methoden das Potential, die PI(4,5)P2-Affinität der Effektoren (z.B. Ionenkanälen) unter physiologischen Bedingungen, wie z.B. in der lebenden Zelle, zu untersuchen. Deshalb müssen die PI(4,5)P2-Affinitäten vieler Proteine immer noch bestimmt werden. In dieser Studie wurde eine spannungsgesteuerte 5’ Phosphatase des Ascids Ciona intestinalis (Ci-VSP) als neues Werkzeug verwendet um die PI(4,5)P2- Affinitäten von Effektoren und Sensoren zu quantifizieren. Ionenkanäle stellen eine Klasse physiologisch relevanter PI(4,5)P2-Effektoren mit verschiedenen PI(4,5)P2- Affinitäten dar und ihre Regulation durch PIs war Gegenstand weitreichender Untersuchungen. Die Aktivität von einwärts rektifizierenden Kalium-(Kir) Kanälen wird z.B. durch die Bindung von PI(4,5)P2 reguliert. Deshalb wurden Kir-Kanäle als Modellsystem verwendet um abzuschätzen, wie gut Ci-VSP geeignet ist, die PI(4,5)P2-Affinität dieser Kanäle festzustellen. Kir-Ströme wurden während der Ci- VSP-Aktivität mit Hilfe von Whole-cell Patch-Clamp an CHO-Zellen und mit Hilfe von Zwei-Elektroden Voltage-Clamp an Xenopus laevis Oocyten abgeleitet. Die Kir- Ströme nahmen bei Depolarisation aufgrund der Ci-VSP-vermittelten PI(4,5)P2- iv Depletion ab und nahmen bei Repolarisation aufgrund der endogenen PI(4,5)P2- Resynthese wieder zu. Der Gleichgewichtszustand der Kanaldeaktivierung bei gradueller Ci-VSP-Aktivierung diente dem Auslesen des Grades der PI(4,5)P2- Affinität. Aufgrund ihrer verschiedenen Affinitäten musste die Ci-VSP unterschiedlich stark aktiviert werden um die untersuchten Kir-Kanäle zu deaktivieren. In Übereinstimmung mit früheren Studien wurde ermittelt, dass Kir2.1WT-Kanäle eine hohe, Kir1.1WT-Kanäle eine mittlere und Kir3-Kanäle eine niedrige PI(4,5)P2-Affinität haben. Ebenfalls wurde die reduzierte PI(4,5)P2-Affinität von Mutanten (z.B. R228Q in Kir2.1), die zu schweren Erkrankungen wie das Anderson Syndrom führen können, erfolgreich mit Hilfe der Ci-VSP detektiert. Genauso konnte erfolgreich die sich ändernde PI(4,5)P2-Affinität von Kir3-Kanälen bei Modulation durch Gβγ nachvollzogen werden. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Verwendung der Ci-VSP, verglichen mit früheren Methoden PI(4,5)P2-Level zu manipulieren und Protein- PI(4,5)P2-Affinitäten zu quantifizieren, eine graduelle und reversible Titration des endogenen PI(4,5)P2 in intakten Zellen erlaubt. Die Reliabilität der Ci-VSP wurde bekräftigt durch den Vergleich der erhaltenen Resultate mit einer unabhängigen Methode PI(4,5)P2 zu depletieren. Die Depletion wurde durch eine chemisch gesteuerte Membranrekrutierung einer 5’ Phosphatase, der Inp54p, erzielt. Die Ströme aller untersuchten Kir-Kanäle nahmen infolge der Inp54p-induzierten PI(4,5)P2-Depletion, ähnlich wie bei Ci-VSPAktivierung beobachtet, ab. Zuletzt wurde die Ci-VSP dazu verwendet die kontroversen PI(4,5)P2- Affinitäten zweier PI(4,5)P2-Bindungsdomänen (PLCδ1-PH-Domäne und tubby-CT) aufzulösen um ihre Tauglichkeit in Bezug auf die Visualisierung von PI(4,5)P2- Dynamiken in künftigen Studien abzuschätzen. Der dynamische Bereich des tubby- CT-Sensors stimmte mit dem physiologischen PI(4,5)P2-Konzentrationsbereich überein, welcher durch die Aktivität von KCNQ2-Kanälen in simultanen Messungen mit Patch-Clamp angezeigt wurde. Zusammengefasst zeigen die Resultate, dass Ci-VSP als neues Werkzeug geeignet ist zuverlässig PI(4,5)P2-Level in lebenden Zellen reversibel und graduell zu manipulieren. Ci-VSP erlaubt die quantitative Ermittlung von PI(4,5)P2-Sensitivitäten zellulärer Effektoren und genetisch kodierter fluoreszierender Sensoren von PI(4,5)P2-Signalwegen.

Zusammenfassung:
Summary Quantification of the in-vivo affinity of PI(4,5)P2 effectors and sensors with the phosphoinositide phosphatase Ci-VSP Phosphoinositides (PIs) constitute a family of membrane phospholipids which play important roles in many eukaryotic signal transduction pathways. The PI phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate (PI(4,5)P2) is predominantly located in the plasma membrane and regulates many cellular functions including protein activation (e.g. ion channels). PI(4,5)P2-mediated signalling usually occurs via dynamic changes in the PI(4,5)P2 concentration. Given the multitude of cellular functions that depend on PI(4,5)P2, it is not fully understood how specificity of signalling is achieved, i.e. how only a subset of potential effector proteins can respond to a given change in the PI(4,5)P2 concentration. One major factor determining signalling specificity may be the PI(4,5)P2 affinity of these effectors. Thus, to understand the impact of dynamic PI(4,5)P2 concentration changes on effector proteins it is necessary to know their PI(4,5)P2 affinity. However, methods to define PI(4,5)P2 affinities used so far have serious limitations in their potential to assess the affinities of PI(4,5)P2 effectors (e.g. ion channels) under physiological conditions, i.e. in the living cell. Therefore, the PI(4,5)P2 affinity of many proteins has yet to be established. In this study, the voltage sensor-containing PI(4,5)P2 5’ phosphatase of Ciona intestinalis (Ci-VSP) was established as a novel tool to quantify the PI(4,5)P2 affinity of effector and sensor proteins. Ion channels are a physiologically relevant class of cellular PI(4,5)P2 effectors with various PI(4,5)P2 affinities, and their regulation by PIs has been the subject of wide-ranging investigation. The activity of inwardly rectifying potassium (Kir) channels, for example, is controlled by PI(4,5)P2 binding. Thus, Kir channels were used as a model system to establish the potential of Ci-VSP for estimating PI(4,5)P2 affinities. Kir currents were recorded during Ci-VSP activity using whole-cell patch-clamp recordings on CHO cells or two-electrode voltage clamp recordings on Xenopus laevis oocytes. Kir currents declined upon depolarization due to PI(4,5)P2 depletion by Ci-VSP activity, and recovered upon repolarization as a result of endogenous PI(4,5)P2 resynthesis. Steady state channel deactivation upon gradual Ci-VSP activation served as a readout for the level of channel-PI(4,5)P2 ii affinity. Different degrees of Ci-VSP activity were required for channel deactivation, consistent with their different PI(4,5)P2 affinities. Kir2.1WT channels were found to have a high PI(4,5)P2 affinity, Kir1.1WT channels an intermediate one, and Kir3 channels a low one. The reduced channel-PI(4,5)P2 affinity occurring as a result of amino acid mutations (e.g. R228Q in Kir2.1) that lead to severe diseases such as Andersen’s syndrome was reliably detected with Ci-VSP. Similarly, using Ci-VSP allowed to track successfully a change in the PI(4,5)P2 affinity of Kir3 channels modulated by Gβγ. These data revealed that Ci-VSP allowed, in contrast to earlier established approaches, the reversible and gradual titration of endogenous PI(4,5)P2 in intact cells. The reliability of Ci-VSP was confirmed by comparison of these results with those obtained with an independent approach to deplete PI(4,5)P2. PI(4,5)P2 depletion was achieved by chemically triggered recruitment of the PI(4,5)P2 5’ phosphatase, Inp54p, to the plasma membrane. Kir currents of all channels investigated declined upon Inp54p-induced PI(4,5)P2 depletion similar to the results obtained with Ci-VSP. Finally, Ci-VSP was used to resolve the controversial PI(4,5)P2 affinities of two PI(4,5)P2 sensor proteins, PLCδ1-PH domain and tubby-CT, with the purpose of assessing their usefulness for monitoring PI(4,5)P2 dynamics in intact cells in future studies. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy on CHO cells showed that the PI(4,5)P2 affinity of tubby-CT is lower than that of PLCδ1-PH domain. The dynamic range of the tubby-CT sensor corresponded to the physiological range of PI(4,5)P2 concentration, as indicated by KCNQ2 channel activity recorded simultaneously by patch-clamp. In conclusion, the results establish Ci-VSP as a novel experimental tool for rapid, reversible and gradual manipulation of PI(4,5)P2 in living cells. Ci-VSP allows for the quantitative examination of PI(4,5)P2 sensitivities of cellular effectors and genetically encoded fluorescent sensors of PI(4,5)P2 signaling.


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