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Titel: Funktionelle Charakterisierung von Peroxisomen in murinen Oozyten
Autor: Fleischer, Hendrik
Weitere Beteiligte: Lüers, Georg (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0348
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0348
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-03480
DDC: 610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Functional characterization of peroxisomes in murine oocytes

Dokument

Schlagwörter:
Real-time PCR, Ether lipids, Peroxisome, Oocyte, Peroxisom, Etherlipidsynthese, Immunofluorescence, Real time quantitative PCR, Oozyte, Immunfluoreszenz

Zusammenfassung:
Peroxisomen sind Zellorganellen mit einer Größe von 0,1 bis 1,5 µm, die in nahezu allen eukaryonten Zellen vorkommen. Sie erfüllen wichtige Aufgaben im intrazellulären Metabolismus von Lipiden und von reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS). Peroxisomen sind dynamische Organellen, deren Gestalt und Enzymausstattung an wechselnde metabolische Bedingungen angepasst werden kann und deren Funktionen in verschiedenen Geweben oder Spezies variiert. Über die Funktion von Peroxisomen in den weiblichen Keimzellen ist bisher nichts bekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Peroxisomen in den Oozyten der Maus zu charakterisieren und zu untersuchen, ob sich diese während der Keimzellreifung verändern. Durch immunfluoreszenzmikroskopischen Nachweis von peroxisomalen Markerproteinen wie Katalase, Pmp70 oder Pex14 konnten wir zeigen, dass Peroxisomen in den Oozyten vorkommen und dass sich ihre Anzahl während der Follikelreifung deutlich vermehrt. Mit Hilfe eines GFP-PTS1-transgenen Mausstammes, in dessen Zellen die Peroxisomen durch das grün fluoreszierende Protein (GFP) markiert sind gelang es erstmals, oozytäre Peroxisomen auch elektronenmikroskopisch zu analysieren. Sie zeigen einen typischen Aufbau und sind in der Peripherie der Oozyten gelegentlich zu kleineren Gruppen zusammengelagert. Um die Funktionen dieser Peroxisomen näher zu charakterisieren haben wir Oozyten isoliert, die Expression von mRNAs für peroxisomale Proteine durch quantitative real-time PCR analysiert und mit der Expression dieser Gene im ganzen Ovar und der Leber als Referenzgewebe verglichen. Die Expression von Genen für Enzyme der etablierten Hauptfunktionen von Peroxisomen wie β-Oxidation oder ROS-Metabolismus war in den Oozyten im Vergleich zur Referenz deutlich vermindert. Die mRNAs für die Glyceronphosphat O-acyltransferase (Dhapat, Gnapat) und die Alkylglyceronphosphat Synthase (Dhap-S, Agps), zwei Schlüsselenzyme der Etherlipidsynthese, die nur in Peroxisomen lokalisiert sind, war jedoch deutlich erhöht. Wir vermuten daher, dass die Synthese von Plasmalogenen, den häufigsten Etherlipiden, zu den spezifischen Funktionen der weiblichen Keimzellperoxisomen gehört. Eine vermehrte Plasmalogensynthese kann durch den erheblichen Membranzuwachs der Oozyte während der Follikelreifung, oder den erhöhten Membranbedarf bei den Furchungsteilungen während der frühen Embryonalentwicklung, erklärt werden. Oozytäre Lipidanalysen sind nun geplant, um die Bedeutung der peroxisomalen Plasmalogensynthese für die Reifung der Oozyten und die frühe Embryonalentwicklung genauer zu untersuchen.

Summary:
Peroxisomes are cell organelles that range in size from 0.1 to 1.5 µm and are present in nearly all eukaryotic cells. They are involved in important functions of the intracellular metabolism of lipids and of reactive oxygen species (ROS). Peroxisomes are highly dynamic organelles that can adapt in shape and protein composition rapidly in response to metabolic demands. Depending on species or tissue type they have distinct functional profiles. However, to date nothing has been described about their function in female germ cells. The aim of this study was to characterize the peroxisomal compartment in mouse oocytes and to analyse possible alterations during oogenesis. Our results obtained by immunofluorescence microscopic analysis of peroxisomal marker proteins like catalase, Pmp70 and Pex14, show the presence of peroxisomes in oocytes and their significant increase in number during folliculogenesis. We have also used a GFP-PTS1 transgenic mouse strain, whose peroxisomes are labelled by the green fluorescent protein (GFP). This allowed us to analyse the peroxisomes in these oocytes by electron and light microscopy. We could show that they have a typical ultrastructure and that they are sometimes arranged in small groups at the oocyte periphery. To characterize the cell type specific metabolic functions of these peroxisomes we isolated oocytes, analysed the levels of mRNAs encoding peroxisomal proteins by real-time PCR and compared the mRNA expression levels with the levels in total ovary and liver tissue. Relative expression levels of genes representing main functions of peroxisomal metabolism like β-oxidation and ROS-metabolism have been strongly reduced in oocytes compared to the reference. The mRNA levels for glyceronephosphate O-acyltransferase (Gnapat, Dhapat) and alkylglycerone phosphate synthase (Agps, Dhaps-S), however, were significantly increased. These are key enzymes involved in the biosynthesis of ether lipids that are exclusively localized in peroxisomes. We therefore suggest that the synthesis of plasmalogens, the most abundant ether lipids, is an important function of peroxisomes in female germ cells. This increased synthesis of plasmalogens could be explained by an increased need of membranes in the oocyte during folliculogenesis or during cleavage divisions in early embryogenesis. Future studies will focus on lipid analysis of oocytes. This will further clarify the physiological role of peroxisomal plasmalogen biosynthesis in the maturation process of oocytes and early embryogenesis.


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