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Titel: Molecular regulation of mitochondrial dynamics by dynamin-related protein 1 (Drp1) and Bid in model systems of neuronal cell death
Autor: Grohm, Julia
Weitere Beteiligte: Culmsee, Carsten (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0340
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0340
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-03402
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Molekulare Regulation von mitochondrialer Dynamik durch Dynamin Protein 1 (Drp1) und Bid in Modellsystemen des neuronalen Zelltodes

Dokument

Schlagwörter:
Oxidative stress, Bid, Drp1, Drp1, Mitochondriale Dynamik, Apoptosis, Bid, Mitochondrium, Oxidativer Stress, Mitochondrial dynamics

Summary:
Mitochondrien sind Schlüsselorganelle in Signalwegen der neuronalen Apoptose und in Entwicklungs- und Alterungsprozessen der Zelle. Mitochondrien sind hoch dynamische Organelle, welche sich abhängig der physiologischen Bedingungen als lange miteinander verbundene Netzwerke oder als kleine, runde Organelle darstellen. Unter pathologischen Bedingungen und im neuronalen Zelltod ist die Regulation der Mitochondrienmorphologie deutlich verändert, wobei das Gleichgewicht der mitochondrialen Dynamik in Richtung Fragmentierung verschoben wird. Entsprechende Veränderungen der Mitochondrien treten z. B. im verzögerten neuronalen Zelltod nach Schlaganfall oder Schädel-Hirn-Trauma auf und vermehrt fragmentierte Mitochondrien sind auch in geschädigtem Hirngewebe bei alters-bedingten neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer und Morbus Parkinson nachgewiesen worden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde vor allem eine neuronale hippokampale Zelllinie (HT-22 Zellen) verwendet, um die Regulation und die Bedeutung der vermehrten Mitochondrienfragmentierung im oxidativen neuronalen Zelltod zu untersuchen. In diesen Zellen führt eine Behandlung mit Glutamat zu einem kontinuierlichen Abfall der intrazellulären Glutathionspiegel und induziert somit oxidativen Stress. Zusätzlich wurden primäre neuronale Zellkulturen und ein in vivo-Modell der zerebralen Ischämie eingesetzt, um die in HT-22 Zellen erhaltenen Ergebnisse zu bestätigen und auszubauen. Der erste Teil dieser Arbeit untersucht, ob verstärkte mitochondriale Fragmentierung den Glutamat-induzierten Zelltod begleitet. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass Glutamat-induzierte Apoptose mit einer verstärkten Fragmentierung von Mitochondrien, dem Verlust von mitochondrialen Membranpotential und einer Umverteilung von fragmentierten Mitochondrien um den Zellkern verbunden ist. Weiter zeigen die hier dargestellten Ergebnisse eine Schlüsselrolle für das BH3-Protein Bid in der mitochondrialen Fragmentierung auf, die durch den oxidativen Stress ausgelöst wurde. Der zweite Teil der Arbeit untersucht die Rolle des Dynamin Proteins Drp1 im neuronalen Zelltod nach Glutamat-Schädigung in HT-22 Zellen und in primären kortikalen Neuronen. Um die Rolle von Drp1 im Glutamat-induzierten Zelltod nachzuweisen, wurde in dem hier angewendeten Modellsystem des oxidativen Stress zum ersten Mal hoch spezifische Drp1 Inhibitoren und Drp1 siRNA angewendet. Die Deletion von Drp1 durch siRNA oder durch den Drp1 Inhibitor zeigen, das mitochondriale Membranpotential aufrechterhalten werden kann und die mitochondriale Fragmentierung in HT-22 Zellen, als auch in primären Neuronen verhindert werden. Der Drp1 Inhibitor blockierte zudem den neuronalen Zelltod nach Sauerstoff-Glukose-Entzug in primären Neuronen und verringert auch signifikant das Infarktvolumen in einem Schlaganfallmodell in Mäusen. Diese Daten heben Drp1 als einen Schlüsselfaktor bei ischämisch- und Glutamat-induziertem neuronalen Zelltod hervor und identifizierten Drp1-abhängige mitochondriale Fragmentierung als eine mögliche therapeutischen Zielstruktur für die Therapie von akuten zerebrovaskulären Erkrankungen. Weitere Untersuchungen zu einer möglichen Wechselwirkung zwischen Bid und Drp1 im neuronalen Zelltod zeigten zudem erstmalig, dass offenbar beide Proteine nach oxidativem Stress zusammen an der Mitochondrienmembran agieren, um intrinsische Signalkaskaden der Apoptose zu induzieren. Die Hemmung eines der Proteine war ausreichend, um die mitochondriale Translokation bzw. die toxischen Effekte des Partners an den Mitochondrien zu hemmen und so den neuronalen Zelltod zu verhindern. Insgesamt konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass Bid und Drp1 zusammen als Schlüsselregulatoren des mitochondrialen neuronalen Zelltodes in HT-22 Zellen agieren und das die Hemmung von Drp1 auch in primären Neuronen, und auch in einem Schlaganfallmodell in Mäusen eine protektive Wirkung vermittelt. Der Bid-vermittelte neuronale Zelltod umfasst Drp1-abhängige mitochondriale Fragmentierung, mitochondriale Umverteilung um den Zellkern, mitochondriale Membranschädigung und die Freisetzung von mitochondrialen Apoptose-Mediatoren wie AIF. Aus diesem Grund sind Bid und Drp1 vielversprechende therapeutische Zielstrukturen, die durch neuartige Inhibitor-Moleküle blockiert werden können, um mitochondriale Fragmentierung und Dysfunktion, als Kennzeichen des neuronalen Zelltodes bei akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen zu verhindern, in denen Glutamatschädigung bzw. oxidativer Stress zu den wesentlichen auslösenden Faktoren für die Nervenschädigung führen.

Zusammenfassung:
Mitochondria are key regulators of neuronal apoptosis, in development and aging. Beside this, mitochondria are highly dynamic organelles which build, dependent on physiological conditions, large interconnected networks or appear as spherical, small rounded organelles. Impaired regulation of mitochondrial dynamics that shifts the balance towards fission is associated with neuronal death in delayed neuronal cell death after acute brain injury by ischemic stroke or brain trauma, and in age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer’s disease or Parkinson’s disease. Emerging evidence suggests that oxidative stress disturbs mitochondrial morphology dynamics, resulting in detrimental mitochondrial fragmentation and dysfunction. In particular, such fatal mitochondrial fission has been detected in neurons exposed to oxidative stress, suggesting mitochondrial dysfunction is a key feature in the intrinsic death pathway. Major parts of the study were performed in a model of glutamate toxicity in immortalized hippocampal HT-22 neurons, since glutamate selectively induced oxidative stress through glutathione depletion in these cells. To verify the relevance of the findings in HT-22 cells for post-mitotic neurons, further experiments included models of glutamate-induced excitotoxicity and oxygen glucose deprivation primary embryonic neurons in vitro and in a mouse model of cerebral ischemia in vivo. The first part of this study investigated, whether enhanced mitochondrial fission accompanied by glutamate-induced neuronal cell death. The present study demonstrated that glutamate-induced apoptosis was associated with enhanced mitochondrial fission, loss of mitochondrial membrane potential and relocation of fragmented mitochondria to the nucleus. Further, the results obtained here provided evidence for a key role of the BH3-only protein Bid in mitochondrial fragmentation of neuronal apoptosis caused by oxidative stress. The mitochondrial fragmentation, the associated loss of the mitochondrial membrane potential, and consequent neuronal cell death were prevented by BI-6c9, a highly specific Bid inhibitor. The second part of this study explored whether Drp1 played a major role in neuronal cell death after glutamate-toxicity in HT-22 cells and primary cortical neurons. To verify the role of Drp1 in glutamate-induced cell death, highly specific small molecule inhibitors of Drp1 and siRNA approaches in neurons were applied in this model-system of oxidative stress in neurons. Data obtained from the present study demonstrated a significant neuroprotective effect through inhibition of Drp1, suggesting that this regulator of mitochondrial fission played a major role in delayed neuronal cell death. This conclusion is based on findings showing that down-regulation of Drp1 by siRNA or by small molecule inhibitors significantly preserved mitochondrial morphology and mitochondrial membrane potential, and reduced glutamate toxicity in neuronal cells. In addition, the Drp1 inhibitors protected primary cortical neurons against oxygen glucose deprivation in vitro, and preserved brain tissue after cerebral ischemia in vivo. These data expose Drp1 as a key factor in ischemic and glutamate-induced neuronal cell death and identify Drp1-dependent mitochondrial fission as a potential therapeutic target in acute cerebrovascular diseases. Finally, studies on the potential interaction between Bid and Drp1 revealed for the first time that both factors cooperate during neuronal apoptosis to mediate mitochondrial fragmentation, loss of mitochondrial membrane integrity and intrinsic apoptosis. Inhibition of either factor was sufficient to block the other’s detrimental effect on mitochondria and execution of neuronal cell death. Overall, data obtained from the present study demonstrate for the first time Bid and Drp1 as the key regulators of mitochondrial neuronal cell death pathways associated with enhanced oxidative stress in HT22 cells and primary neuronal cells as well as in the mouse model of cerebral ischemia, respectively. Bid-mediated neuronal cell death involves Drp1-dependent mitochondrial fission, mitochondrial relocation to the nucleus, mitochondrial membrane permeabilization, and release of mitochondrial cell death regulators such as AIF. Therefore, the presented data expose the inhibition of Bid by BI-6c9 and Drp1 using mdivi-1 compounds as a promising therapeutic target to prevent mitochondrial fragmentation and dysfunction which are hallmarks of neuronal cell death in acute and chronic neurodegenerative diseases, where glutamate toxicity and oxidative stress are prominent.


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