Dokument

Summary:
Mitochondrien sind Schlüsselorganelle in Signalwegen der neuronalen Apoptose und in Entwicklungs- und Alterungsprozessen der Zelle. Mitochondrien sind hoch dynamische Organelle, welche sich abhängig der physiologischen Bedingungen als lange miteinander verbundene Netzwerke oder als kleine, runde Organelle darstellen. Unter pathologischen Bedingungen und im neuronalen Zelltod ist die Regulation der Mitochondrienmorphologie deutlich verändert, wobei das Gleichgewicht der mitochondrialen Dynamik in Richtung Fragmentierung verschoben wird. Entsprechende Veränderungen der Mitochondrien treten z. B. im verzögerten neuronalen Zelltod nach Schlaganfall oder Schädel-Hirn-Trauma auf und vermehrt fragmentierte Mitochondrien sind auch in geschädigtem Hirngewebe bei alters-bedingten neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer und Morbus Parkinson nachgewiesen worden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde vor allem eine neuronale hippokampale Zelllinie (HT-22 Zellen) verwendet, um die Regulation und die Bedeutung der vermehrten Mitochondrienfragmentierung im oxidativen neuronalen Zelltod zu untersuchen. In diesen Zellen führt eine Behandlung mit Glutamat zu einem kontinuierlichen Abfall der intrazellulären Glutathionspiegel und induziert somit oxidativen Stress. Zusätzlich wurden primäre neuronale Zellkulturen und ein in vivo-Modell der zerebralen Ischämie eingesetzt, um die in HT-22 Zellen erhaltenen Ergebnisse zu bestätigen und auszubauen. Der erste Teil dieser Arbeit untersucht, ob verstärkte mitochondriale Fragmentierung den Glutamat-induzierten Zelltod begleitet. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass Glutamat-induzierte Apoptose mit einer verstärkten Fragmentierung von Mitochondrien, dem Verlust von mitochondrialen Membranpotential und einer Umverteilung von fragmentierten Mitochondrien um den Zellkern verbunden ist. Weiter zeigen die hier dargestellten Ergebnisse eine Schlüsselrolle für das BH3-Protein Bid in der mitochondrialen Fragmentierung auf, die durch den oxidativen Stress ausgelöst wurde. Der zweite Teil der Arbeit untersucht die Rolle des Dynamin Proteins Drp1 im neuronalen Zelltod nach Glutamat-Schädigung in HT-22 Zellen und in primären kortikalen Neuronen. Um die Rolle von Drp1 im Glutamat-induzierten Zelltod nachzuweisen, wurde in dem hier angewendeten Modellsystem des oxidativen Stress zum ersten Mal hoch spezifische Drp1 Inhibitoren und Drp1 siRNA angewendet. Die Deletion von Drp1 durch siRNA oder durch den Drp1 Inhibitor zeigen, das mitochondriale Membranpotential aufrechterhalten werden kann und die mitochondriale Fragmentierung in HT-22 Zellen, als auch in primären Neuronen verhindert werden. Der Drp1 Inhibitor blockierte zudem den neuronalen Zelltod nach Sauerstoff-Glukose-Entzug in primären Neuronen und verringert auch signifikant das Infarktvolumen in einem Schlaganfallmodell in Mäusen. Diese Daten heben Drp1 als einen Schlüsselfaktor bei ischämisch- und Glutamat-induziertem neuronalen Zelltod hervor und identifizierten Drp1-abhängige mitochondriale Fragmentierung als eine mögliche therapeutischen Zielstruktur für die Therapie von akuten zerebrovaskulären Erkrankungen. Weitere Untersuchungen zu einer möglichen Wechselwirkung zwischen Bid und Drp1 im neuronalen Zelltod zeigten zudem erstmalig, dass offenbar beide Proteine nach oxidativem Stress zusammen an der Mitochondrienmembran agieren, um intrinsische Signalkaskaden der Apoptose zu induzieren. Die Hemmung eines der Proteine war ausreichend, um die mitochondriale Translokation bzw. die toxischen Effekte des Partners an den Mitochondrien zu hemmen und so den neuronalen Zelltod zu verhindern. Insgesamt konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass Bid und Drp1 zusammen als Schlüsselregulatoren des mitochondrialen neuronalen Zelltodes in HT-22 Zellen agieren und das die Hemmung von Drp1 auch in primären Neuronen, und auch in einem Schlaganfallmodell in Mäusen eine protektive Wirkung vermittelt. Der Bid-vermittelte neuronale Zelltod umfasst Drp1-abhängige mitochondriale Fragmentierung, mitochondriale Umverteilung um den Zellkern, mitochondriale Membranschädigung und die Freisetzung von mitochondrialen Apoptose-Mediatoren wie AIF. Aus diesem Grund sind Bid und Drp1 vielversprechende therapeutische Zielstrukturen, die durch neuartige Inhibitor-Moleküle blockiert werden können, um mitochondriale Fragmentierung und Dysfunktion, als Kennzeichen des neuronalen Zelltodes bei akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen zu verhindern, in denen Glutamatschädigung bzw. oxidativer Stress zu den wesentlichen auslösenden Faktoren für die Nervenschädigung führen.

Bibliographie / References

1. Chen,H., Chomyn,A., and Chan,D.C. 2005. Disruption of fusion results in mitochondrial heterogeneity and dysfunction. J. Biol. Chem. 280:26185-26192.
2. Suen,D.F., Norris,K.L., and Youle,R.J. 2008. Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 22:1577-1590.
3. Knott,A.B., and Bossy-Wetzel,E. 2008. Impairing the mitochondrial fission and fusion balance: a new mechanism of neurodegeneration. Ann N Y Acad Sci 1147:283-292.
4. S Tobaben, J Grohm, A Dolga, N Plesnila, C Culmsee, 12/15-lipoxygenases are key regulators of mitochondria damage and sustained disturbances of calcium homeostasis in glutamate-induced neurotoxicity / p141, 17th ECDO Euroconference. Destruction, Degradation and Death, Cell Death Control in Cancer and Neurodegeneration. Institut Pasteur, Paris, Frankreich, 22.09-26.09.2009
5. S Tobaben, J Grohm, M Hoehn, N Plesnila, C Culmsee, 12/15-Lipoxygenases mediate mitochondrial AIF release and mitochondrial fission upstream of Bid in oxidative stressinduced neuronal cell death, Nr.: D09, Jahrestagung der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft, DPhG, Jena, Deutschland, 28.9.2009-01.10.2009 143
6. Zarkovic,K. 2003. 4-hydroxynonenal and neurodegenerative diseases. Mol. Aspects Med. 24:293-303.
7. Hattori,Y., Hattori,S., and Kasai,K. 2001. 4-hydroxynonenal prevents NO production in vascular smooth muscle cells by inhibiting nuclear factor-kappaB- dependent transcriptional activation of inducible NO synthase. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21:1179-1183.
8. S Tobaben, A Dolga, J Grohm, M Conrad, N Plesnila, C Culmsee, Activation of 12/15- lipoxygenases plays a key role in neuronal cell death induced by oxidative stress, Nr.:
9. J Grohm, A Cassidy-Stone, J Nunnari, C Culmsee, A small molecule inhibitor of Bid prevents mitochondrial fission and cell death signaling in neurons exposed to oxidative stress, 50. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie Mainz, Deutschland 10.03.2009-12.03.2009
10. Almeida,A., and Bolanos,J.P. 2001. A transient inhibition of mitochondrial ATP synthesis by nitric oxide synthase activation triggered apoptosis in primary cortical neurons. J. Neurochem. 77:676-690.
11. Oral presentations J Grohm, A Cassidy-Stone, J Nunnari, N Plesnila, C Culmsee, Bid and Drp1 are key regulators of mitochondrial dynamics in cell death in neurons, Naunyn-Schmiedeberg`s Arch Pharmacology (2010) 381 (Suppl 1):1-92 Nr.: 198, 51. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie Mainz, Germany, 23.03.2010-25.03.2010
12. J Grohm, Bid and Drp1 regulate mitochondrial dynamics in neuronal cell death, Invited talk at the Department of Molecular & Cellular Biology, J. Nunnari, UC Davis, Davis, California, USA, 19.11.2010
13. S Tobaben, J Grohm, A Seiler, M Conrad, N Plesnila, C Culmsee, Bid-induced damage of mitochondrial integrity play a key role in neuronal oxytosis, Naunyn- Schmiedeberg`s Arch Pharmacology (2010) 381 (Suppl 1):1-92 Nr.: 69; 51.
14. S Tobaben, J Grohm, A Seiler, M Conrad, N Plesnila, C Culmsee, Bid-mediated mitochondrial damage accelerates glutamate-induced oxidative stress and AIF- dependent death in neurons, Cell Death and Differentiation, 18: 282-292, 2011
15. Lutter,M., Fang,M., Luo,X., Nishijima,M., Xie,X., and Wang,X. 2000. Cardiolipin provides specificity for targeting of tBid to mitochondria. Nat. Cell Biol. 2:754- 761.
16. JE Slemmer, C Zhu, S Landshamer, R Trabold, J Grohm, A Ardeshiri, E Wagner, MI Sweeney, K Blomgren, C Culmsee, JT Weber, N Plesnila, Causal Role of Apoptosis- Inducing Factor for Neuronal Cell Death Following Traumatic Brain Injury, Am. J. Pathol., 173: 1795-1805, 2008
17. Curriculum vitae Personal data Date of birth: 24.06.1982
18. Destruction, Degradation and Death, Cell Death Control in Cancer and Neurodegeneration. Institut Pasteur, Paris, Frankreich, 22.09-26.09.2009
19. J Grohm, SW Kim, U Mamrak, A Cassidy-Stone, J Nunnari, N Plesnila, C Culmsee, Dynamin-related protein 1 (Drp1) as therapeutic target to prevent mitochondrial pathways of neuronal cell death in vitro and in vivo, Restorative Neurology and Neuroscience; Special Issue: Abstracts of the 6th international Symposium on Neuroprotection and Neurorepair RNNEEL 28 (5) 605-716, IOS Press, Nr.: PP IV-2; 6th international Symposium on Neuroprotection and Neurorepair, Rostock, Germany 01.10.2010-04.10.2010
20. Nakamura,T., and Lipton,S.A. 2008. Emerging roles of S-nitrosylation in protein misfolding and neurodegenerative diseases. Antioxid. Redox. Signal. 10:87- 101.
21. Knott,A.B., and Bossy-Wetzel,E. 2010. Impact of nitric oxide on metabolism in health and age-related disease. Diabetes Obes. Metab 12 Suppl 2:126-133.
22. Wang,X., Su,B., Lee,H.G., Li,X., Perry,G., Smith,M.A., and Zhu,X. 2009. Impaired balance of mitochondrial fission and fusion in Alzheimer's disease. J. Neurosci. 29:9090-9103.
23. Culmsee, Inhibition of Dynamin-realted protein 1 (Drp1) prevents mitochondrial fission and provides neuroprotection in vitro and in a mouse model of cerebral ischemia Submitted for publication J Grohm, N Plesnila and C Culmsee, Bid mediates fragmentation, membrane permeabilization and perinuclear accumulation of mitochondria as a prerequisite for oxidative neuronal death, Brain, Behavior, and Immunity, 24: 831-838, 2010
24. S Diemert, S Tobaben, J Grohm, R Hartmannsgruber, N Plesnila, C Culmsee, Inhibition of p53 preserves mitochondrial morphology and function protects against glutamate-induced cell death, Restorative Neurology and Neuroscience; Special Issue: Abstracts of the 6 th international Symposium on Neuroprotection and Neurorepair RNNEEL 28 (5) 605-716, IOS Press, Nr.: PP IV-1; 6th international Symposium on Neuroprotection and Neurorepair, Rostock, Germany 01.10.2010-04.10.2010
25. Jahrestagung der Deutschen Germany 23.03.2010-25.03.2010
26. Lipoxygenases play a key role in AIF mediated neuronal cell death induced by oxidative stress, Restorative Neurology and Neuroscience; Special Issue: Abstracts of the 6 th international Symposium on Neuroprotection and Neurorepair RNNEEL 28 (5)
27. Ishihara,N., Nomura,M., Jofuku,A., Kato,H., Suzuki,S.O., Masuda,K., Otera,H., Nakanishi,Y., Nonaka,I., Goto,Y., Taguchi,N., Morinaga,H., Maeda,M., Takayanagi,R., Yokota,S., and Mihara,K. 2009. Mitochondrial fission factor Drp1 is essential for embryonic development and synapse formation in mice. Nat. Cell Biol. 11:958-966.
28. Perfettini,J.L., Roumier,T., and Kroemer,G. 2005. Mitochondrial fusion and fission in the control of apoptosis. Trends Cell Biol 15:179-183.
29. Lipton,S.A. 1999. Neuronal protection and destruction by NO. Cell Death. Differ. 6:943-951.
30. Brown,G.C. 2010. Nitric oxide and neuronal death. Nitric. Oxide. 23:153-165.
31. Knott,A.B., and Bossy-Wetzel,E. 2008. Nitric Oxide in Health and Disease of the Nervous System. Antioxid Redox Signal.
32. J Grohm, S Tobaben, S Diemert, C Culmsee, Pharmacological inhibition of mitochondria fission exerts neuroprotective effects in neurons exposed to oxidative stress, Nr.: D08, Jahrestagung der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft, DPhG, Jena, Deutschland, 28.9.2009-01.10.2009
33. J Grohm, SW Kim, A Cassidy-Stone, J Nunnari, N Plesnila, C Culmsee, Pharmacological inhibitors of dynamin-related protein (Drp1) prevent mitochondrial fission and neuronal cell death in vitro and in vivo / p106, 17th ECDO Euroconference.
34. Farooqui,A.A., and Horrocks,L.A. 2006. Phospholipase A2-generated lipid mediators in the brain: the good, the bad, and the ugly. Neuroscientist. 12:245- 260.
35. Posttranslational N-myristoylation of BID as a molecular switch for targeting mitochondria and apoptosis. Science 290:1761-1765.
36. IOS Press, Nr.: PP III-27; 6th international Symposium on Neuroprotection and Neurorepair, Rostock, Germany 01.10.2010-04.10.2010
37. S Diemert, J Grohm, S Tobaben, A Dolga, C Culmsee, Real-Time Detection of neuronal Cell Death by Impedance-Based Analysis using the xCELLigence System, Application Note, Issue 06, Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Penzberg, Germany, 2010
38. Brooks,C., and Dong,Z. 2007. Regulation of mitochondrial morphological dynamics during apoptosis by Bcl-2 family proteins: a key in Bak? Cell Cycle 6:3043-3047.
39. AM Dolga, J Grohm, S Pfeifer, S Tobaben, N Plesnila, C Culmsee, Small conductance KCa2.2 channels are essential for preventing delayed calcium deregulation in models of glutamate toxicity, N.: 341.13/F56, Society for Neuroscience Annual Meeting, Neuroscience 2010, San Diego, USA, 13.11.2010-17.11.2010
40. J Grohm, A Cassidy-Stone, J Nunnari, C Culmsee, The Bid inhibitor BI-6c9 prevents mitochondrial fission and cell death in neurons exposed to oxidative stress, 9th International Conference AD/PD 2009, Prag, Tschechische Republik, 11.03- 15.03.2009
41. Nelson,E.J., Connolly,J., and McArthur,P. 2003. Nitric oxide and S-nitrosylation: excitotoxic and cell signaling mechanism. Biol. Cell 95:3-8.
42. Alirol,E., James,D., Huber,D., Marchetto,A., Vergani,L., Martinou,J.C., and Scorrano,L. 2006. The mitochondrial fission protein hFis1 requires the endoplasmic reticulum gateway to induce apoptosis. Mol. Biol. Cell 17:4593- 4605.
43. Brooks,C., Wei,Q., Feng,L., Dong,G., Tao,Y., Mei,L., Xie,Z.J., and Dong,Z. 2007. Bak regulates mitochondrial morphology and pathology during apoptosis by interacting with mitofusins. Proc Natl Acad Sci U S A 104:11649-11654.
44. Karbowski,M., Arnoult,D., Chen,H., Chan,D.C., Smith,C.L., and Youle,R.J. 2004. Quantitation of mitochondrial dynamics by photolabeling of individual organelles shows that mitochondrial fusion is blocked during the Bax activation phase of apoptosis. J Cell Biol 164:493-499.
45. Caspase cleavage product of BAP31 induces mitochondrial fission through endoplasmic reticulum calcium signals, enhancing cytochrome c release to the cytosol. J. Cell Biol. 160:1115-1127.
46. Karbowski,M., Lee,Y.J., Gaume,B., Jeong,S.Y., Frank,S., Nechushtan,A., Santel,A., Fuller,M., Smith,C.L., and Youle,R.J. 2002. Spatial and temporal association of Bax with mitochondrial fission sites, Drp1, and Mfn2 during apoptosis. J. Cell Biol. 159:931-938.
47. Billen,L.P., Kokoski,C.L., Lovell,J.F., Leber,B., and Andrews,D.W. 2008. Bcl-XL inhibits membrane permeabilization by competing with Bax. PLoS Biol 6:e147.
48. Mitra,K., Wunder,C., Roysam,B., Lin,G., and Lippincott-Schwartz,J. 2009. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 106:11960-11965.
49. Wakabayashi,J., Zhang,Z., Wakabayashi,N., Tamura,Y., Fukaya,M., Kensler,T.W., Iijima,M., and Sesaki,H. 2009. The dynamin-related GTPase Drp1 is required for embryonic and brain development in mice. J. Cell Biol. 186:805-816.
50. Lutz,A.K., Exner,N., Fett,M.E., Schlehe,J.S., Kloos,K., Lammermann,K., Brunner,B., Kurz-Drexler,A., Vogel,F., Reichert,A.S., Bouman,L., Vogt- Weisenhorn,D., Wurst,W., Tatzelt,J., Haass,C., and Winklhofer,K.F. 2009. Loss of parkin or PINK1 function increases Drp1-dependent mitochondrial fragmentation. J. Biol. Chem. 284:22938-22951.
51. Chen,H., Vermulst,M., Wang,Y.E., Chomyn,A., Prolla,T.A., McCaffery,J.M., and Chan,D.C. 2010. Mitochondrial fusion is required for mtDNA stability in skeletal muscle and tolerance of mtDNA mutations. Cell 141:280-289.
52. Bossy,B., Petrilli,A., Klinglmayr,E., Chen,J., Lutz-Meindl,U., Knott,A.B., Masliah,E., Schwarzenbacher,R., and Bossy-Wetzel,E. 2010. S-Nitrosylation of DRP1 does not affect enzymatic activity and is not specific to Alzheimer's disease. J. Alzheimers. Dis. 20 Suppl 2:S513-S526.
53. Perkins,G., Bossy-Wetzel,E., and Ellisman,M.H. 2009. New insights into mitochondrial structure during cell death. Exp. Neurol. 218:183-192.
54. Wei,M.C., Zong,W.X., Cheng,E.H., Lindsten,T., Panoutsakopoulou,V., Ross,A.J., Roth,K.A., MacGregor,G.R., Thompson,C.B., and Korsmeyer,S.J. 2001. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science 292:727-730.
55. Nakamura,T., and Lipton,S.A. 2010. S-Nitrosylation of Critical Protein Thiols Mediates Protein Misfolding and Mitochondrial Dysfunction in Neurodegenerative Diseases. Antioxid. Redox. Signal.
56. J Grohm, SW Kim, A Cassidy-Stone, J Nunnari, N Plesnila, C Culmsee, Inhibition of dynamin-related protein (Drp1) prevents mitochondrial fission and neuroprotection in vitro and in vivo, N.: 440.13/O14, Society for Neuroscience Annual Meeting, Neuroscience 2009, Chicago, USA, 17.10.2009-21.10.2009
57. Lee,Y.J., Jeong,S.Y., Karbowski,M., Smith,C.L., and Youle,R.J. 2004. Roles of the mammalian mitochondrial fission and fusion mediators Fis1, Drp1, and Opa1 in apoptosis. Mol Biol Cell 15:5001-5011.
58. Poster presentations 2010
59. Lutter,M., Perkins,G.A., and Wang,X. 2001. The pro-apoptotic Bcl-2 family member tBid localizes to mitochondrial contact sites. BMC. Cell Biol. 2:22.
60. Kroemer,G., Galluzzi,L., and Brenner,C. 2007. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol Rev 87:99-163.

Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten