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Titel: Die Rolle der Ca2+-aktivierten K+-Kanäle KCa3.1 und KCa2.3 bei retinalen Angiogeneseprozessen
Autor: Rappert, Denis
Weitere Beteiligte: Köhler, Ralf (Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0306
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-03069
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0306
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): The role of Ca2+ activated potassium channels KCa3.1 and KCa2.3 in retinal angiogenesis

Dokument

Schlagwörter:
Angiogenesis, Angiogenese, Retina <Druckschrift>, K+-Kanal, Netzhaut, Potassium-channels

Zusammenfassung:
Angiogeneseprozesse spielen in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen eine wichtige Rolle. Neuere Forschungen legen nahe, dass auch endotheliale Ca2+-abhängige K+-Kanäle KCa3.1 und KCa2.3 wichtig für Angiogeneseprozesse sein könn-ten. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob ein Verlust oder eine Überstimulation oben genannter Kanäle – durch genetischen Knockout oder Induktion – einen Einfluss auf die morphologische und quantitative Vaskularisierung der Retina von juvenilen, 5- und 7-Tage alten, sowie von adulten, 30-Tage alten transgenen Tieren hat. Es wurden ver-schiedene bestehende Tiermodelle herangezogen, es waren der spezifische Knockout eines oder beider Kanäle, die Überexpression von KCa2.3 sowie eine Kombination von Knockout und Überexpression möglich. Es konnten bestehende und neue Methoden zur Retina-Präparation und Visualisierung der Netzhaut-Gefäße herangezogen und partiell entwickelt werden. Durch die Kombination eines ersten Typ IV Kollagen Antikörpers und eines zweiten, mit Alexa Fluor gekoppelten Antikörpers gegen den Ersten wurde eine sehr zuverlässige und homogene immunhistochemische Anfärbung der Gefäße erreicht. In einem weiteren Schritt wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop durch technisch-optische Hilfsmittel der Hauptgefäßplexus der Retina isoliert dargestellt und aus Einzelbildern ein digitales Bild der gesamten Retina erstellt. Auf dieses Abbild des Gefäßnetzes wurden verschiedene Arten der Auswertung angewandt, um die morpholo-gischen Gefäßveränderungen quantitativ und qualitativ beurteilen zu können. Bei der Flächenanalyse wurde mittels einer Grauwert-Analyse ausgewertet, wie viel der Ge-samtfläche eines Präparates mit Gefäßen bedeckt ist. Bei einer anderen Analyse wurden die Verzweigungen der Gefäße in definierten Arealen bestimmt um auf die Dichte des Kapillarnetzes Rückschlüsse zu ziehen. Als letztes wurden ebenfalls in definierten Arealen die Durchmesser sowohl kleiner als auch großer Gefäße bestimmt, um zu se-hen, ob bei den verschiedenen Tiermodellen Unterschiede in der Größe der Gefäße be-stehen. Es konnte hier gezeigt werden, dass der Knockout des KCa3.1-Kanals mit einer Zunahme der Anzahl der Gefäße in der Retina einhergeht, speziell die Anzahl der Verzweigungen der Gefäße sind signifikant höher. Auch der Knockout des KCa2.3-Kanals hat proangiotische Auswirkungen auf die Retina, was sich ebenfalls in einer Erhöhung der Verzweigungen äußert. Ausgeprägter war diese Beobachtung bei einem Knockout beider Kanäle. Der Durchmesser der Arteriolen und Kapillaren ist in allen Gruppen unverändert. Bei sehr jungen, 5- und 7-Tage alten Tieren zeichnen sich in der Tendenz gleichgerichtete Veränderungen ab, wie sie in adulten Tieren beobachtet werden. Die Eigenschaften der verwendeten Tiermodelle erlaubten Untersuchungen, in denen der KCa2.3-Kanal überexprimiert wird. Hier zeigte sich sowohl bei KCa2.3T/T transgenen Tieren als auch bei KCa3.1-/-/ KCa2.3T/T doppeltransgenen Tieren eine den Wildtypen vergleichbare Gefäßdichte bei Überexpression von KCa2.3. In Bezug auf die Rolle der Kanäle KCa3.1 und KCa2.3 wurde in der vorliegenden Arbeit die These der Einflussnahme auf Angiogeneseprozesse beider Kanäle dargelegt. Es ist denkbar, dass sich diese Kanäle in Zukunft als ein lohnendes Ziel für pharmakologische Beeinflussung von Gefäßwachstum und Neoangiogenese herausstellen.

Summary:
Angiogenesis plays an important role in many physiological and pathological processes. It is well known that the stimulation for vessel growth is controlled by ion channels in the endothelial cell membrane. Recent results suggest that the two calcium dependant potassium channels KCa3.1 and KCa2.3 are also important for angiogenesis. In this dissertation I investigated whether a change of expression in terms of knockout or upregulation affect the morphological and quantitative vascularisation of the retina. Analysis took place in young, 5- and 7-days old mice and in adult, 30-days old mice in different types of transgenic animals. It was possible to either specifically knockout one of the two channels, overexpress KCa2.3 or to combine knockout and overexpression. For the evaluation it was necessary to use and refine existing and to develop new methods for the preparation and visualisation of the retinal vessels. A very reliable and homogeneous immuno-histochemical staining of the vessels was reached by combining two antibodies. The first one was a type IV Kollagen antibody and the second one, coupled with alexa fluor, was specific to the first one. The preparation was then used to produce a graph of the main retinal vessel plexus of the retina and to obtain a picture of the complete retina via technical-optical methods. The so obtained picture was analysed using different methods to qualitatively and quantitatively determine the morphological changes of the vessels. A grey scale analysis was used to determine which percentage of the total area was covered with vessels. Additionally, the branching of the vessels in certain areas was evaluated to obtain the density of the capillary plexus. Finally, the diameter of both small as well as large vessels was measured to examine whether there are differences between the animal models. It was possible to show that the knockout of the KCa3.1 channel coincides with a increase of vessels in the retina, and specifically with a significant increase of the vascular branching. Similarly, the knockout of the KCa2.3 channel effects proangiotic changes in the retina, also causing an increase in the branching. Furthermore, the knockout of both channels increases the vascular branching as compared to the knockout of only one channel. However, the diameter of the capillars is not changed in any group of animal models. For the very young, five and seven day old, animals the results are less obvious and there are no clear differences between the different animal models, even though tendencies similar to the adult mice are discernible. Additionally, the used animal models allowed for investigation of the effects of overexpression of the KCa2.3 channel on the vascularisation of the retina. KCa2.3T/T transgenic animals and double transgenic animals KCa3.1-/-/ KCa2.3T/T with an overexpression of KCa2.3 showed a vessel density compared to the Wildtypes. The dependence of the KCa3.1 and KCa2.3 channels for angiogenetic effects have been shown in this dissertation. It is possible that these channels could be a useful target for pharmacological manipulation of neovascularisation and vessel growth.


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