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Titel: Functional analysis of non-viral miRNA replacement therapy in colon carcinoma in vitro and in vivo
Autor: Ibrahim, Ahmed Fawzy Moustafa
Weitere Beteiligte: Aigner, Achim (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0273
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-02735
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0273
DDC: 610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Funktionelle Analyse von Micro-RNAs Einschleusungs-Therapie in Kolonkarzinomen in vitro und in vivo

Dokument

Schlagwörter:
Small RNA, Small RNA, Colonkrebs, colon cancer

Summary:
MicroRNAs (miRNAs) are small RNA molecules with perfect or imperfect homology to their target mRNA. They have been shown to specifically interfere with the expression of their target protein(s). Moreover, microRNAs play an important role in the pathogenesis of cancer, where some microRNAs act as tumor suppressors by targeting lethal oncogenes, and others act as oncogenes by targeting suppressor genes. Thus, microRNAs can be involved directly or indirectly in important cellular processes such as proliferation, differentiation and apoptosis. Understanding the functions and importance of microRNAs could lead to the discovery of new strategies for controlling of cancer. This thesis was aiming at the possibility of using non-viral delivery systems for microRNAs into mammalian cell lines, and examined their efficacies. To this end, three different transfection reagents, linear Jet-PEI, branched PEI F25-LMW and INTERFERin, were used in vitro, either commercially available or prepared in our lab. The work was concentrating on colon cancer as a tumor model, and two representative cell lines, LS174t and HCT-116, were selected as a platform to conduct the experiments. The studies focused on miR-143 and miR-145, which had been implicated previously with cancer development and progression. It was found in miRNA transfection experiments that miR-143 and miR-145, which are downregulated in colon cancer, have the ability to inhibit the progression of the cancer through different regulatory mechanisms, proliferation and apoptosis. Some important genes, which play important roles in tumorigenesis and tumor progression, were found to be negatively regulated by both miR-143 and miR-145. More specifically, ERK5 (Mitogen Activated Protein Kinase) which plays an essential role in the proliferation of colon cancer was suppressed by miR-143 and miR-145. Likewise, c-Myc was negatively regulated by miR-145, but these results were only at the protein level, i.e., no significant effects were determined on c-Myc transcription. Furthermore, it was found that the^inhibitory effects were depending on several factors such as cell line, transfection reagent, time of incubation and concentration of miRNA complex. Thus, the cellular delivery of microRNAs miR-143 and miR-145 showed profound inhibitory effects on the proliferation and soft agar colony formation of LS174t and HCT- 116 cells, and induced apoptosis in LS174t cells. Moreover, miR-145 was examined for its tumor inhibitory effect in vivo. To this end, athymic nude mice bearing s.c. colon carcinoma xenografts were treated with PEIcomplexed miR-145 by systemic or local injection. Profound anti-tumor effects upon PEImediated miR-145 delivery were found which were again dependent on the downregulation of specific target genes. Taken together, microRNA replacement therapy may represent a promising approach in tumor treatment, and this thesis establishes the PEI-mediated therapeutic delivery of miR- 145 in colon carcinoma.

Zusammenfassung:
MicroRNAs (miRNAs) sind kleine RNA-Moleküle mit vollständiger oder unvollständiger Homologie zu ihrer Ziel-mRNA. Damit sind sie in der Lage, spezifisch die Expression einzelner Proteine zu beeinflussen. MicroRNAs spielen eine wichtige Rolle in der Krebs- Pathogenese, indem einige miRNAs gegen Onkogene gerichtet sind und somit als Tumor- Suppressoren fungieren, während andere miRNAs Onkogene darstellen und gegen Tumor- Suppressoren gerichtet sind. MiRNAs können somit direkt oder indirekt an wichtigen zellulären Prozessen wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose beteiligt sein. Das Verständnis ihrer Funktionen und ihrer Relevanz könnte zur Entwicklung neuer Strategien in der Kontrolle von Tumoren führen. Diese Arbeit untersuchte die Möglichkeit und Effizienz nicht-viraler Einschleusungssysteme für miRNAs in Tumor-Zellen. Hierzu wurden zunächst in vitro drei verschiedene Transfektionsreagenzien, lineares Jet-PEI, verzweigtes PEI F25-LMW und INTERFERin untersucht, die entweder kommerziell erhältlich oder im Labor hergestellt worden waren. Die Experimente konzentrierten sich auf das Kolonkarzinom als Tumormodell, und zwei repräsentative Zelllinien, LS174t und HCT-116, wurden für die Experimente ausgewählt. Als miRNAs wurden miR-143 und miR-145 eingesetzt, auf deren Rolle in Tumorentstehung und in Tumorprogression es aus Vorstudien bereits Hinweise gab. Es wurde in miRNA-Transfektionsexperimenten gefunden, dass miR-143 und miR-145, deren Level im Kolonkarzinom vermindert sind, die Tumorprogression durch verschiedene regulatorische Mechanismen wie Proliferation und Apoptose steuern können. Wichtige Gene mit funktioneller Relevanz in Tumorigenese und Tumor-Progression wurden durch miR-143 und miR-145 negativ reguliert. So wurde ERK5 (mitogene activated protein kinase), das eine wichtige Rolle in der Proliferation von Kolonkarzinom- Zellen spielt, durch miR-143 und miR-145 supprimiert. Gleichfalls wurde eine negative Regulation von c-Myc durch miR-145 ermittelt, jedoch nur auf Proteinlevel und nicht auf der Ebene der Transkription. Es wurde ferner gefunden, dass die inhibierenden Effekte abhängig waren von verschiedenen Einflüssen und Parametern wie Zelllinie, Transfektionsreagenz, Inkubationszeit und Konzentration des miRNA-Komplexes. Die zelluläre Einschleusung der microRNAs miR-143 und miR-145 zeigte folglich deutliche inhibierende Effekte auf die Proliferation und die Soft-Agar Kolonienbildung von LS174t und HCT-116-Zellen, sowie eine Apoptose-Induktion in LS174t-Zellen. Weiterhin wurden die Tumor-inhibierenden Effekte von miR-145 in vivo untersucht. Hierzu wurden athymische Nacktmäuse mit s.c. Tumor-Xenotransplantaten mit PEIkomplexierter miR-145 durch systemische oder lokale Injektion behandelt. Es wurden nach der PEI-vermittelten miRNA-Einschleusung deutliche Antitumor-Effekte beobachtet, die wiederum auf der Herunterregulation von spezifischen tumorrelevanten Zielgenen basierten. Zusammenfassend kann die miRNA replacement therapy somit einen viel versprechenden neuen Ansatz in der Tumorbehandlung darstellen, und diese Arbeit etabliert die PEIvermittelte therapeutische Einschleusung von miR-145 in vivo in Kolonkarzinom- Xenotransplantaten.


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