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Titel: Functional characterization of a seven-WD40 repeat protein Rak1 in Ustilago maydis
Autor: Wang, Lei
Weitere Beteiligte: Kahmann, Regine (Prof. Dr. )
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0115
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0115
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-01159
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Funktionale Charakterisierung des sieben-WD40-Domänen Proteins RACK1 in Ustilago maydis

Dokument

Schlagwörter:

Summary:
In dem pflanzenpathogenen Brandpilz Ustilago maydis wird die Paarungsreaktion zweier kompatibler Zellen durch ein Pheromon/Rezeptor System koordiniert. Der Pheromon Stimulus wird dabei über ein konserviertes MAP Kinase Modul übermittelt was zur Aktivierung von Prf1 führt, einem essentiellen Regulator für sexuelle und pathogene Entwicklung. Um zusätzliche Komponenten des MAP kinase Signalwegs zu finden, wurde U. maydis Rak1, ein sieben-WD40-Domänen Protein, ein Ortholog von RACK1 in Säugerzellen, untersucht. In U. maydis wird rak1 konstitutiv exprimiert und lokalisiert im Zytoplasma und in der Membran. Rak1 spielt eine Rolle in der Aufrechterhaltung der Zellwandintegrität und in der Regulation des Zellwachstums und konnte den bei erhöhten Temperaturen auftretenden Wachstumsphänotyp von Saccharomyces cerevisiae asc1 Mutanten komplementieren. Die Deletion von rak1 führte zu einer deutlichen Reduktion der Bildung von Konjugationshyphen und resultierte damit in dramatisch reduzierter Paarungseffizienz. Dieser Effekt konnte auf die reduzierte Expression des Pheromon- und des Pheromonrezeptor-Gens zurückgeführt werden. Durch die genetische Aktivierung des MAP kinase Moduls konnte die Bildung von Konjugationshyphen in FB1Drak1 wieder hergestellt werden. Weiterhin konnte die Konjugationshyphenbildung durch konstitutive Expression des Pheromonrezeptor Gens pra1 oder des Pheromon aktivierten Transkriptionsfaktors prf1 und gleichzeitiger Gabe von kompatiblem Pheromon wiederhergestellt werden. In solopathogenen Stämmen führte die Deletion von rak1 zu abgeschwächter Filamentbildung sowie Pathogenität, was durch Expression des kompatiblen bE/bW Heterodimers komplementiert werden konnte. Diese Analyse erlaubte es rak1 genetisch oberhalb von prf1 zu platzieren. Durch Mikroarray-Analyse konnten 201 Gene identifiziert werden, die in dem rak1 Deletionsstamm differenziell reguliert sind. 163 induzierte Gene zeigten eine signifikante Anreicherung in den funktionellen Kategorien Metabolismus, Energie, Virulenz und Stress- bzw. Toxinresistenz. Die 38 reprimierten Gene zeigten eine signifikante Anreicherung im Lipidstoffwechsel, Fermentation und einem MAPK abhängigen Signalweg. Unter den reprimierten Genen in FB1Drak1 wurde rop1 gefunden, ein direkter positiver transkriptioneller Regulator von prf1. Die konstitutive Expression von rop1 in FB1Drak1 führte zur Induktion der Expression von mfa1 und der Pheromon-abhängigen Konjugationshyphenbildung. Zusammenfassend wirkt Rak1 als neuartiger Regulator der rop1 und dadurch prf1 Genexpression während der Kreuzungsreaktion und der pathogenen Entwicklung.

Zusammenfassung:
In the phytopathogenic smut fungus Ustilago maydis cell fusion of compatible haploid cells is controlled by a pheromone/receptor system. The pheromone signal is transmitted via a conserved MAP kinase module that activates Prf1, an essential regulator of sexual and pathogenic development. To find additional components in MAP kinase signaling, U. maydis Rak1, a seven-WD40 repeat motif protein that is orthologous to mammalian RACK1 was studied. rak1 gene was constitutively expressed and Rak1 protein localized in the cytoplasm as well as in the membrane fraction. In U. maydis Rak1 was found to affect cell wall synthesis and cell growth and could partially complement the growth phenotype of Saccharomyces cerevisiae asc1 mutant at elevated temperature. Deletion of rak1 strongly attenuated conjugation tube formation in haploid cells resulting in poor mating ability. This defect could be traced back to reduced expression of the pheromone and pheromone-receptor genes. With the genetic activation of the MAP kinase module, the formation of conjugation tubes of FB1 rak1 could be rescued. Furthermore, the defect of FB1Drak1 in conjugation tube formation could be restored by the constitutive expression of the pheromone receptor gene pra1 or the pheromone response transcription factor prf1 upon pheromone stimulation. In solopathogenic strain the deletion of rak1 led to attenuated filamentation and pathogenicity, which could be rescued by the constitutive expression of an active bE/bW heterodimer. This analysis made it likely that rak1 controls the expression of prf1. By microarray analysis, 201 genes were identified to be differentially regulated in the rak1 deletion strain. 163 up-regulated genes showed a significant enrichment in the functional categories like metabolism, energy, virulence and stress and toxin resistance. 38 down-regulated genes showed a significant enrichment in lipid metabolism, fermentation and a MAPK signaling-dependent pathway. Among the down-regulated genes in FB1Δrak1, rop1, a direct positive transcriptional regulator of prf1, was detected. The constitutive expression of rop1 in FB1Δrak1 could induce the expression of mfa1 as well as conjugation tube formation in response to pheromone stimulation. Collectively, rak1 functions as a novel regulator of rop1 and consequently of prf1 gene expression during mating and pathogenic development.


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