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Titel: Sepsis Proteome Analysis by the Combination of Immunodepletion, Two-dimensional HPLC and nanoLC-MS/MS
Autor: Zhang, Wei
Weitere Beteiligte: Marahiel, Mohamed A (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0110
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0110
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-01109
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Analyse des Proteoms der Sepsispatienten mittels Immunodepletion, Zweidimensionaler HPLC und nanoLC-MS/MS

Dokument

Schlagwörter:
Tandem-Massenspektrometrie, immunodepletion, Sepsis, Biomarker, Proteomanalyse, HPLC

Summary:
Sepsis, defined as the systemic host response to infection, is not a single disease but a complex and heterogenous process. Effective therapies and their evaluation have been hampered by insufficient characterization of the underlying pathogenesis and in consequence limited ability to stratify patients into more homogenous subgroups. As no single or any combination of biomarkers at present can reliable be used for prediction there is an immense and vast growing interest in protein profiling. The proteomic analysis of plasma samples represents a challenge due to the presence of a few highly abundant proteins such as albumin and immunoglobulins in addition to the desired biomarkers of interest that are typically low in abundance. The detection of possible biomarkers therefore requires a specific depletion of these high abundance proteins and/or optimized multidimensional protein fractionation methods based on charge, size, hydrophobicity or any combination therefore. The IgY-PF2D-nanoLC-MS/MS strategy applied in this study combines immunoaffinity subtraction chromatography (IgY-12) for the removal of high abundance plasma proteins with two-dimensional protein fractionation (PF2D) for separation and nano LC-MS/MS for identification of proteins. In this study, plasma samples from patients with sepsis and healthy controls were examined. More than 120 adult patients with manifest sepsis, severe sepsis and septic shock were included. Citrated plasma samples from five male patients with a clinically similar cause of sepsis and underlying disease were used for this part of the study. The plasma samples were taken from three survivors and two non-survivors at the first (diagnosis of sepsis) and last day (relocation or death) of their stay in the intensive care unit (ICU) respectively. Citrated plasma samples from three age matched healthy male individuals were used as reference. A total of 1,800 fractions were analyzed and 233 distinct proteins were identified with. 132 proteins from healthy male individuals, identified by double and/or triple determination with high reliability, were regarded as the reference protein pool. Only significantly up-regulated peaks present in all of the sepsis samples were selected for MS analysis, resulting in the identification of 17 distinct proteins present only in septic patients. Whereas most of these proteins are known to be involved in inflammatory response, some are considerably novel and exploring their roles in association with the pathophysiology of sepsis may lead to the identification of new biomarkers for sepsis.

Zusammenfassung:
Sepsis ist eine infektionsinduzierte Inflammationsreaktion des Körpers, wobei die Intensität des infektiösen Triggers nicht mit der Intensität der Antwortreaktion des Wirtsorganismus kongruent sein muss. Während eine kontrollierte lokal be-schränkte inflammatorische Reaktion der Elimination der Infektion dient, kann sie unkontrolliert systemisch zu einer Vielzahl von Ereignissen führen, die letztendlich im Multiorganversagen enden kann. Pathogenetisch bedeutsam ist hierbei die aus der Dysfunktion des unspezifischen Immunsystems resultierende Gerinnungsaktivierung und endotheliale Dysfunktion. Die frühe Erkennung der Sepsis und die Vorhersage der Mortalität sind zwingend notwendig für eine weitere Senkung der immer noch hohen Sepsissterblichkeit weltweit. Die bisherigen Sepsismarker sind für diese Aufgabe nur unzureichend geeignet. In der vorliegenden Arbeit sollte mit Hilfe eines neuen Flüssigkeitschromatografie- basierten Verfahrens zur differenziellen Proteomanalyse versucht werden, Biomarkerkandidaten aus Plasmaproben von Sepsispatienten zu identifizieren. Dabei wurde das Proteinreinigungssystem ProteomeLab IgY-12 zur Abtrennung der 12 High-Abundance-Plasmaproteine eingesetzt. Anschließend erfolgte mit dem Proteinseparationssystem Proteome Lab PF2D eine zweidimensionale Auftrennung der Proteine nach isoelektrischem Punkt und Hydrophobizität. Die integrierte DeltaVue Software zeigt die Unterschiede zwischen normalen und septischen Proteomen an. Die differenziell dargestellten Peaks wurden, fraktioniert gesammelt, zur weiteren Identifizierung potentieller Biomarker anhand von nano LC-MS/MS analysiert. Nach verschiedenen Optimierungsschritten zeigte sich die angewandte „IgY-PF2D-nanoLC-MS/MS“ – Strategie als effektive und effiziente Methode zur differentiellen Proteomanalyse humaner Plasmaproben. In der vorliegenden Studie wurden Plasmaproben von gesunden Probanden und Patienten mit Sepsis untersucht. Von den 124 Patienten mit Sepsis, schwerer Sepsis und septischen Schock wurden Plasmaproben von 5 männlichen Patien¬ten mit ähnlicher Krankengeschichte und Sepsisursache für die differenzielle Proteomanalyse verwendet. Als Referenzproteom wurden Plasmaproben von 5 gesunden männlichen Probanden (altersgematcht) herangezogen. Insgesamt wurden 1800 Fraktionen analysiert und 233 einzelne Proteine identifiziert. 17 Proteine, die nur in den Patientenproben mit Sepsis vorkamen, wurden als Biomarkerkandidaten postuliert. Neben bekannten Akute – Phase – Proteinen wurden auch einige neue Proteine wie z. B. Lumican, Urinary Protease Inhibitor und Cationic trypsinogen als putative Sepsismarker identifiziert, deren Rolle in der Sepsispathogenese noch zu klären sind. Alle 17 Biomarkerkandidaten sollten nun in weiteren gezielten Studien hinsichtlich ihres diagnostischen und prognostischen Wertes überprüft werden.


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