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Titel: Tetraether lipid Liposomes for the Preparation of Novel Liposomal Drug Carriers
Autor: Özcetin, Aybike
Weitere Beteiligte: Bakowsky, Udo (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0109
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0109
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-01091
DDC: Naturwissenschaften
Titel(trans.): Tetraetherlipid-Liposomen zur Herstellung von Neuen Liposomalen Arzneistoffträgern

Dokument

Schlagwörter:
Concanavalin A, Imatinib, Tyrosinkinaseinhibitor, Concanavalin A, Chorioallantoische Membran, Imatinib, Tetraether lipid liposome, Chorioallantoic Membrane, Tetraetherlipid-Liposomen, Tyrosine Kinase Inhibitor

Summary:
Liposomes currently have a broad spectrum of medical applications, especially in diagnostics and therapy. Stability of the liposomal drug carriers is one of the most important limitations, which concerns fast elimination of vesicles in the human body. Therefore in this thesis, very stable tetraether lipid liposomes were prepared and characterized. The study consists of the investigation of stability properties of tetraether lipid liposomes, the lectin conjugation onto the liposomal membrane, tyrosine kinase inhibitor encapsulation and characterization of these liposomes. These investigations were structured in five chapters: Chapter 1 introduced the tetraether lipid liposomes, their extraction and preparation methods, stability properties and pharmaceutical applications. In this context, modification and application of the tetraether lipid liposomes as drug delivery systems were also discussed. This chapter focused on the application of liposomes in the field of cancer therapy as anti-angiogenic drug carriers. Chapter 2 describes the tetraether lipid liposomes which were tailored with an archaeal lipid, Glycerol Dialkyl Nonitol Tetraether (GDNT), isolated from the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Investigations of thermal stability, stability during autoclavation and pH stability were carried out. Furthermore, morphological images were presented. In this chapter a special lipid was isolated and purified for the preparation of liposomal vesicles. Liposomes tailored with GDNT showed high stability in various pH and temperature conditions. The results showed that the GDNT liposomes are even stable after autoclavation. The second chapter was presented in the form of a protocol. Chapter 3 describes stability properties of tetraether lipid liposomes under conditions simulating the pulmonary system and gastrointestinal tract. The tetraether lipids were isolated from the thermoacidophilic archaeon Thermoplasma acidophilum. In contrast to the liposome formulations presented in Chapter 2, these liposomes were prepared with total tetraether lipids instead of a specific type of tetraether lipid. In addition to studies of pH stress and stability during autoclavation, the stability properties of these liposomes were investigated in fetal calf serum and lung surfactant conditions. The TEL content of the liposomes provides extreme stability to the liposomes which is very promising for drug delivery and targeting systems. The results of this work are considered as a preliminary study to elucidate the optimal ratio of tetraether lipid and conventional lipid for the following studies. Chapter 4 deals with lectin-carbohydrate interactions. The model lectin Concanavalin A (ConA) extracted from the Jack-bean Canavalia ensiformis was used to modify tetraether lipid liposomes. ConA binds to sugar domains localized on inflamed tissues or tumors. The ConA modified TEL liposomes provide an effective targeting mechanism to the inflamed area or tumors. The polymeric form of the sugar mannose, ―mannan‖, was used for the surface modification of a bio-chip. This bio-chip simulated the carbohydrate residues on the cell surface. The binding properties of ConA- modified liposomes onto the mannan coated chip surface were investigated with Reflectometric Interference Spectroscopic (RIfS) measurements which were performed with a BIAffinity device and subsequently with Atomic Force Microscopy (AFM). These measurements provide full information about the binding characteristics of ConA onto the mannan surface. In this regard, ConA can be considered as a useful model for the investigation of specific biomarkers. In the future, ligand conjugated TEL liposomes may serve as efficient carriers for specific drug targeting. Chapter 5 presents an anti-angiogenic effect of a tyrosine kinase inhibitor entrapped in tetraether lipid liposomes to protect the drug and to decrease the adverse effects on the organism. The anti-angiogenic effect was determined by investigation of blood vessels on a chorioallantoic membrane (CAM) model, especially because of its dense capillary network and eligibility of continuous screening of the implant. Besides in ovo investigations, anti-angiogenic effects of the tyrosine kinase inhibitor ―imatinib‖ entrapped tetraether liposomes were elucidated with cell viability and Western blot assays. According to the comparative results of application between imatinib solution and imatinib encapsulated tetraether lipid liposomes, tetraether lipid liposomes were considered to be promising carriers for tyrosine kinase inhibitors due to the high anti-angiogenesis efficiency with much lower drug concentration. This approach yields to decrease the undesirable side effects of the drug and reduces the amount of drug necessary for an efficient therapy.

Zusammenfassung:
Liposomen bieten ein breites Spektrum an medizinischen Anwendungsmöglichkeiten, besonders in der Diagnostik und der Therapie. Die Stabilität der Liposomen als Wirkstoffträger stellt dabei eine der größten Einschränkungen in der Anwendung dar, da die Gefahr eines schnellen Abbaus der Vesikel im menschlichen Körper besteht. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit hochstabile Tetraetherlipid-Liposomen (TEL-Liposomen) hergestellt und charakterisiert. Die vorliegende Arbeit umfasst die Untersuchung der Stabilität von Tetraetherlipid-Liposomen, die Lectinbindung dieser Liposomen und schließlich Liposomen als Träger eines Anti-Angiogenese-Wirkstoffes. Diese Untersuchungen sind in fünf Kapiteln strukturiert. Kapitel 1 gibt eine Einführung in Tetraetherlipid-Liposomen, stellt Methoden zur Extraktion und Reinigung vor und beschreibt pharmazeutische Anwendungsmöglichkeiten. Darüber hinaus werden Modifikationen von TEL-Liposomen und deren Nutzung zum Wirkstofftransport diskutiert. Der Fokus dieses Kapitels liegt auf dem Einsatz von Liposomen als Antiangiogenese-Wirkstofftransporter in der Krebstherapie. Kapitel 2 charakterisiert Tetraetherlipid-Liposomen, die aus einem Archea-Lipid, Glycerol-Dialkyl-Nonitol-Tetraether (GDNT), hergestellt wurden, das aus dem thermoacidophilen Archaeon Sulfolobus acidocaldarius isoliert wurde. Es wurden Untersuchungen zur Thermostabilität, Stabilität während des Autoklavierens und pH-Stabilität durchgeführt. Weiterhin wurde eine morphologische Charakterisierung vorgenommen. In diesem Kapitel wurde ein spezifisches Lipid isoliert und gereinigt, um Liposomen herzustellen. Liposomen aus GDNT weisen eine hohe Stabilität in unterschiedlichen pH- und Temperaturbedingungen auf. Es konnte gezeigt werden, dass GDNT-Liposomen sogar nach dem Autoklavieren stabil bleiben. Kapitel 2 liegt in Form eines Methodenprotokolls vor. Kapitel 3 beschreibt die Stabilitätseigenschaften von Tetraetherlipid-Liposomen unter Bedingungen, die die physiologischen Gegebenheiten im Atmungssystem und Magen-Darm-Trakt simulieren. Hierzu wurden Tetraether-Lipide aus dem thermoacidophilen Archaeon Thermoplasma acidophilum isoliert. Im Gegensatz zu den in Kapitel 2 vorgestellten Liposomzusammensetzungen wurden hier Liposomen aus dem Gesamtumfang der isolierten Tetraether-Lipide anstatt aus einer bestimmten Fraktion hergestellt. Zusätzlich zu Untersuchungen der Stabilität unter pH-Stress und Autoklavierungs-Bedingungen wurden die Liposomen in fetalem Kälberserum und Lungen-Surfactant untersucht. Der TEL-Anteil in den Liposomen verhilft ihnen dabei zu hoher Stabilität. Dies ist vielversprechend für einen späteren Einsatz im zielgerichteten Wirkstofftransport. Diese Untersuchungen können als Vorversuche zur Ermittlung der optimalen Lipidzusammensetzung von Liposomen angesehen werden, die in den weiterführenden Studien genutzt werden sollen. Kapitel 4 beschäftigt sich mit Lectin-Kohlenhydrat-Interaktionen. Das Lektin Concavalin A (ConA), gewonnen aus der Jackbohne Canavalia ensiformis, wurde hier zur Modifikation von Tetraetherlipid-Liposomen eingesetzt. ConA bindet an Zuckerdomänen, wie sie in entzündetem Gewebe oder Tumoren vorkommen. Die ConA – modifizierten TEL-Liposomen stellen somit eine effektive Methode zur gezielten Anwendung in solchen Geweben dar. Die Polymerform des Zuckers Mannose, „Mannan―, wurde zur Beschichtung eines Bio-Chips genutzt, so dass Kohlenhydratreste auf einer Zelloberfläche simuliert werden konnten. Die Affinität der ConA – modifizierten Liposomen zum mannanbeschichteten Biochip wurde mittels Reflektrometrischer Interferenzspektroskopie untersucht, die mit einem BIAffinity-Gerät durchgeführt wurde, und weiterhin mittels Rasterkraftmikroskopie. Diese Messungen erlauben die vollständige Charakterisierung der Bindung von ConA an die Mannanoberfläche. In diesem Zusammenhang kann die ConA-Modifikation der TEL-Liposomen als Modellversuch für die Untersuchung spezifischer Biomarker betrachtet werden. Künftig könnten TEL-Liposomen als wirksame zielgerichtete Wirkstoffträger zum Einsatz kommen. Kapitel 5 schildert den Antiangiogenese-Effekt des Tyrosinkinaseinhibitos „imatinib―, der in TEL-Liposomen eingschlossen wurde, um den Wirkstoff zu schützen und Nebenwirkungen auf den Organismus zu minimieren. Der Antiangiogenese-Effekt wurde an Blutgefäßen in einem CAM-Modell (Chorioallantoische Membran im Hühnerei) untersucht, insbesondere aufgrund des dichten Kapillarnetzwerks und der Eignung für kontinuierliche Beobachtung des Implantats. Neben den in-ovo-Untersuchungen wurde der Antiangiogenese-Effekt der imatinib-beladenen TEL-Liposomen mittels Zellviabilität- und Western-Blot-Analysen charakterisiert. Aufgrund der gewonnen Erkenntnisse im direkten Vergleich von imatinib-geladenen TEL-Liposomen mit imatinib-Lösung konnten die TEL-Liposomen als vielversprechende Vektoren für Tyrosinkinaseinhibitoren dargestellt werden, da sie eine hohe Antiangiogeneseeffizienz mit einer niedrigeren Wirkstoffkonzentration erreichen. Dieser Ansatz soll helfen, unerwünsche Nebeneffekte des verwendeten Wirkstoffes zu minimieren und reduziert die für eine Therapie notwendige Wirkstoffmenge auf ein Mindestmaß.


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