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Titel: Immunfluoreszenz-Basierte Hochdurchsatzanalyse Identifiziert MK5 als Myc-Regulierende Kinase
Autor: Kreß, Theresia
Weitere Beteiligte: Lingelbach, Klaus (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0105
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-01051
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0105
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Immunofluorescence-Based High Throughput Analysis Identifies MK5 as Myc-Regulating Kinase

Dokument

Schlagwörter:
MK5, FoxO, Myc, Darmkrebs, miRNS, FoxO, Posttranskriptionelle Regulation, MK5

Zusammenfassung:
Der Transkriptionsfaktor Myc spielt eine entscheidende Rolle bei der Tumorentstehung und dem Tumorwachstum. Dabei ist das MYC-Gen in humanen Tumoren selten mutiert, sondern häufig sind Mechanismen der post-transkriptionellen Regulation der Myc- Proteinexpression verändert. Zur Identifikation unbeschriebener Mechanismen der Regulation der Myc-Proteinexpression wurde ein Immunfluoreszenz-basiertes Hochdurchsatzanalyse-Verfahren entwickelt und etabliert. Die Hochdurchsatzanalyse von RNAi-Bibliotheken, die das humane Kinom als Zielproteine auswiesen, identifizierte die Proteinkinase MK5/MAPKAPK5/PRAK als ein Enzym, das die Myc-Proteinexpression negativ reguliert. Die MK5-Depletion führt zu einer erhöhten Myc-Proteinexpression, während die MK5-Überexpression die Myc-Proteinexpression vermindert. Diese Myc- Regulation ist entscheidend am Zellwachstum von Tumorzelllinien beteiligt. MK5 phosphoryliert den Transkriptionsfaktor FoxO3a an mehreren, teilweise evolutionär hoch-konservierten Serin-Resten: S215, S253, S551, S555. Die Phosphorylierung von S215 wurde in vivo bestätigt und trägt wesentlich zur nukleären FoxO3a-Akkumulation bei. Nach Aktivierung durch MK5 bindet FoxO3a direkt an den Promotor der microRNAs miR-34b/c und induziert deren Expression. miR-34b und miR-34c binden an das 3’-UTR der MYC-mRNA und hemmen deren Translation und somit die Myc-Proteinexpression. Bei MK5 handelt es sich um ein aktiviertes Zielgen des Myc-Transkriptionsfaktors, der direkt an die E-Box-Region innerhalb des MK5-Promotors bindet. Hierdurch ergibt sich ein negativer Rückkopplungsmechanismus bestehend aus Myc, MK5, FoxO3a und miR-34b/c. Dieser negative Rückkopplungsmechanismus spielt eine entscheidende Rolle bei der Kolonkarzinogenese. Beim Übergang vom gut- zum schlecht-differenzierten kolorektalen Adenokarzinom wird die MK5-mRNA- und Proteinexpression vermindert. Hierdurch erhöht sich die Myc-Proteinexpression, was zur Tumorprogression und zur Metastasierung führt.

Summary:
The transcription factor Myc plays an essential role in tumor development, growth and maintenance. The MYC gene itself is mutated only rarely. In most tumors, mechanisms of post-transcriptional regulation of the MYC mRNA or the Myc protein expression are altered. To identify novel mechanisms of post-transcriptional regulation of Myc, a high throughput screening platform was developed and established. High throughput analyses using RNAi libraries targeting the human kinome identified the protein kinase MK5/MAPKAPK5/PRAK as negative regulator of Myc protein expression. Depletion of MK5 increased Myc protein expression whereas overexpression of MK5 reduced Myc levels. MK5 directly phosphorylates the transcription factor FoxO3a at multiple serine residues in vitro: S215, S253, S551 and S555. Phosphorylation of S215 was confirmed in vivo using a phospho-specific antibody. Phosphorylation of S215 induces nuclear localization of FoxO3a. After activation by MK5, FoxO3a binds to the promoter of the miR-34b/c and induces their transcription. miR-34b and miR-34c bind to the 3’-UTR of the MYC mRNA, inhibit its translation and therefore reduce Myc protein expression. In addition, Myc binds to the E-box region within the MK5 promoter and induces its transcription. Therefore, MK5 itself is a direct target of the Myc transcription factor, creating a negative feedback loop consisting of Myc, MK5, FoxO3a and miR-34b/c. This negative feedback loop plays an important role in suppressing the progression of colon carcinogenesis. However, at the transition from well-differentiated to un-differentiated colorectal adenocarcinomas, MK5 mRNA as well as MK5 protein expression is reduced. This leads to increased Myc protein expression, tumor progression as well as metastasis.


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