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Titel: Die Rolle der Extrazellulärdomäne beim agonistenabhängigen und agonistenunabhängigen Aktivierungsprozess des LH-Rezeptors
Autor: Nurwakagari, Pascal
Weitere Beteiligte: Bünemann, Moritz (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0097
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0097
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-00973
DDC: Naturwissenschaften
Titel(trans.): The role of the LH receptor ectodomain for agonist-dependent and agonist-independent receptor activation

Dokument

Schlagwörter:
activation, Glykoproteinhormon-Rezeptor, Extrazellulärdomäne, Domäne <Biochemie>, Aktivierung, Aktivierungsprozess, Rezeptoraktivierung, Ligand <Biochemie>, LH-receptor, Glycoprotein hormone receptor, Lutropin, Luteinisierendes Hormon, Lutropin receptor, Extracellular domain, Rezeptor, Glykoproteinhormon

Zusammenfassung:
Der Lutropin/Choriongonadotropin-Rezeptor (LHR) sowie die übrigen Glykoproteinhormon-Rezeptoren, Thyreotropin-Rezeptor (TSHR) und Follitropin-Rezeptor (FSHR), stellen Vertreter der rhodopsinähnlichen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren dar. Glykoproteinhormon-Rezeptoren spielen eine entscheidende Rolle bei Wachstum und Funktion der Gonaden sowie der Schilddrüse. Genetische Veränderungen in diesen Rezeptoren können die Ursache für endokrinologische Erkrankungen wie z. B. Pubertas praecox oder Leydigzell-Hypoplasie darstellen. Um Strategien zur Behandlung dieser Erkrankungen entwickeln zu können, ist ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen der Aktivierung dieser Rezeptoren essentiell. In der vorliegenden Arbeit ist die Rolle der Extrazellulärdomäne (EZD) innerhalb des Aktivierungsprozesses des LHR untersucht worden. Hierfür sind LHR mit Hilfe gentechnischer Methoden verändert und in einem heterologen Expressionssystem hinsichtlich ihres Zelloberflächen-„Targeting“ und ihrer Signaltransduktionseigenschaften untersucht worden. Die funktionelle Analyse von N-terminal modifizierten LHR ergab, dass die EZD, entgegen Berichten zum nahe verwandten TSHR, nicht als intramolekularer inverser Agonist auf die Transmembrandomäne (TMD) wirkt, sondern vielmehr einen Beitrag zu einem aktiven Rezeptorzustand des LHR leistet. Das Entfernen oder Verkürzen der EZD resultiert in Rezeptoren, die im Vergleich zum Wildtyp LHR eine erniedrigte basale Rezeptoraktivität aufweisen. Darüber hinaus konnte festgestellt werden, dass die meisten natürlich vorkommenden TMD-Mutationen, die beim Wildtyp LHR eine deutlich erhöhte Rezeptoraktivität hervorrufen, in LHR ohne EZD nicht aktiv sind. Weitere Versuche zeigten, dass die EZD des LHR nicht ausreichend durch die EZD anderer Glykoproteinhormon-Rezeptoren funktionell ersetzt werden kann. Nach Austausch der arteigenen EZD gegen die EZD des TSHR konnten natürlich vorkommende, in der TMD des LHR lokalisierte, aktivierende Mutationen nicht ihre volle Wirkung entfalten und in den meisten Fällen keinen ausgeprägten aktiven Rezeptorzustand hervorrufen. Die EZD des nahe verwandten TSHR scheint entweder als inverser Agonist auf die LHR-TMD zu wirken oder ist aufgrund von Unterschieden in der Aminosäuresequenz zur LHR-EZD nicht in der Lage, eine aktive LHR-Konformation, die für aktivierende Mutationen empfänglich ist, zu unterstützen. Über Ligand-Rezeptor-Fusionsproteine konnte gezeigt werden, dass eine intakte LHR EZD für eine ligandenvermittelte Rezeptoraktivität zwingend notwendig ist und dass das Hormon per se keine Rezeptoraktivierung induzieren kann. Weitere Versuchsergebnisse bestätigten die Hypothese, dass die LHR-EZD – und speziell die LRR-Domäne – intakt sein muss, damit die EZD eine durch das Hormon oder Mutationen hervorgerufene aktive Rezeptorkonformation unterstützen kann. Die vorliegende Arbeit liefert neue Erkenntnisse bezüglich der Rolle der EZD innerhalb des Aktivierungsprozesses von Glykoproteinhormon-Rezeptoren. Anhand der Untersuchungen zu dieser Arbeit kann gezeigt werden, dass die EZD nicht ausschließlich für die Bindung des Hormons verantwortlich ist, sondern darüber hinaus einen erheblichen Beitrag zur Induktion eines aktiven Rezeptorzustandes leistet. Des Weiteren liefert die Arbeit Erkenntnisse dafür, dass die EZD und die TMD entgegen der vorherrschenden Meinung keine strukturell und funktionell unabhängigen Rezeptorbausteine darstellen. In der Regel muss innerhalb des Aktivierungsprozesses eine Wechselwirkung von der EZD mit der G-Protein-koppelnden TMD erfolgen.

Summary:
Glycoprotein hormone receptors such as the lutropin/chorionic gonadotropin receptor (LHR), the thyrotropin receptor (TSHR) and the follicle-stimulating hormone receptor (FSHR) are members of the rhodopsin-like G-protein coupled receptor superfamily and play a pivotal role in growth and function of the gonads and the thyroid gland. Gain-of-function mutations in glycoprotein hormone receptor genes are frequently associated with endocrine dysfunctions such as testicular disorders. A detailed understanding of the mechanism of glycoprotein hormone receptor activation is mandatory for the development of new pharmacological strategies for therapeutic intervention of such dysfunctions. In the present study, the role of the extracellular domain (EZD) for the activation of the LHR was examined. Genetically modified LHR were designed and functionally analyzed in a heterologous expression system by determining receptor protein expression and insertion into the cell membrane as well as receptor-dependent basal and agonist-induced cAMP accumulation. Functional analysis revealed that the LHR-EZD does not function as an inverse agonist but contributes to an active receptor conformation. Partial or total deletion of the EZD resulted in LHR with decreased basal receptor activity when compared to the wildtype LHR. Furthermore, most naturally occurring TMD mutations which induce high ligand-independent receptor activity in the wildtype LHR, were not active in EZD deficient LHR. Additional experiments revealed that the LHR-EZD cannot fully functionally be replaced by the EZD of the closely related TSHR, since swapping of the EZD in the LHR for the EZD of the TSHR impaired the activity of naturally occurring activating TMD mutations. There may be two reasons for this observation: Firstly, the EZD of the TSHR serves as an inverse agonist constraining the LHR-TMD in an inactive conformation, or secondly, due to primary sequence differences between the LHR- and the TSHR-EZD, the TSHR-EZD is not capable to support an LHR-TMD conformation susceptible to activating mutations. The data observed for ligand-receptor chimeras indicate that an intact LHR-EZD is required for ligand-dependent receptor activation and that the hormone per se is unable to activate the TMD of the LHR. Additional experiments support the notion that the integrity of the EZD, particularly the intactness of the LRR domain, is a prerequisite for the ability of the LHR-EZD to support an active receptor conformation induced by the hormone and activating mutations. Altogether, this study provides new insights in the role of the EZD in the activation process of glycoprotein hormone receptors. The data observed in this study strengthen the concept of a major contribution of the LHR-EZD in the activation mechanism apart from hormone binding and provide evidence for a cooperative model with structural and functional interactions of the EZD and the TMD. Thus, our study challenges the prevailing concept that the hormone-binding EZD and the G-protein-coupling TMD are structurally and functionally independent modules of glycoprotein hormone receptors.


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