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Titel: Entwicklung, Synthese und Charakterisierung neuartiger Furininhibitoren
Autor: Becker, Gero Lutz
Weitere Beteiligte: Steinmetzer, Torsten (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0080
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-00804
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0080
DDC: Chemie
Titel(trans.): Development, Synthesis and Characterization of novel Furin Inhibitors

Dokument

Schlagwörter:
Peptidmimetika, Influenza, Solid phase peptide synthesis, Furin, Festphasenpeptidsynthese, Influenza, Furininhibitoren, Peptide mimetics, Furin inhibitors, Inhibitor, Vogelgrippe, Furin
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Zusammenfassung:
In der vorliegenden Arbeit wurden neuartige, effektive, peptidomimetische Inhibitoren der Proproteinkonvertase Furin synthetisiert und charakterisiert. Ausgehend von der Struktur des irreversiblen Referenzinhibitors Decanoyl-RVKR-chlormethylketon wurden Verbindungen entwickelt, in die anstelle des P1 Arg-chlormethylketon-Segmentes decarboxylierte Arginin- und Lysinmimetika sowie weitere zyklische basische Reste eingebaut wurden. Der Decanoyl-Rest wurde zunächst durch einen Phenylacetyl- oder Acetylrest sowie das Lysin in der P2-Position durch Arginin ersetzt. Die auf die Synthese folgende Bestimmung der Inhibitorkonstanten ergab, dass als wirksamster Inhibitor Phenylacetyl-RVR-4-(amidino)benzylamid (17) Furin mit einem Ki-Wert von 0,81 nM hemmt. Basierend auf dieser Leitstruktur wurden zur weiteren Optimierung verschiedene Inhibitorserien synthetisiert, bei denen nacheinander in allen Positionen der Struktur (P2-P5) verschiedene natürliche und unnatürliche Aminosäurereste oder Aminosäurederivate eingebaut wurden. So konnte gezeigt werden, dass der Austausch des P4-Arginins durch ein Lysin oder die Eliminierung der basischen Gruppe in der P2-Position zu einer drastischen Reduktion der inhibitorischen Effektivität führt. Der systematische Einbau aller proteinogenen Aminosäuren in die P3-Position zeigte, dass fast alle Derivate dieser Serie Furin effektiv hemmen, dabei waren neben Valin auch Isoleucin, Phenylalanin oder Tyrosin besonders geeignet. Der Einbau saurer Aminosäuren an dieser Stelle führte jedoch zu weniger wirksamen Inhibitoren, wahrscheinlich bedingt durch elektrostatische Abstoßung aufgrund des stark negativ geladenen, aktiven Zentrums des Furins. In der P5-Position wurden verschiedene Fettsäurereste eingebaut. Die Bestimmung der Inhibitorkonstanten ergab, dass sie bis zu einer Länge von 10 Kohlenstoffatomen annähernd im Bereich der Leitstruktur (17) liegt. Die weitere Verlängerung der Kohlenstoffkette führte allerdings zu einem sukzessiven Abfall der inhibitorischen Wirkung. Die Synthese von Inhibitoren mit basischen P5-Resten führte zu sehr potenten Wirkstoffen, von denen sich 3-(Guanidinomethyl)phenylacetyl-RVR-4-(amidino)benzylamid (38) mit einem Ki-Wert von 5,6 pM als der effektivste Inhibitor für Furin herausstellte. Untersuchungen zur Stabilität einiger Verbindungen mittels HPLC zeigten, dass unter den gewählten Bedingungen kein nennenswerter Zerfall oder Abbau nachzuweisen war. Als Beispiel dient Inhibitor 17, der in wässriger Lösung über 10 Tage bei Raumtemperatur stabil ist. In Zusammenarbeit mit der AG Garten (Institut für Virologie der Universität Marburg) wurden ausgesuchte Inhibitoren auf ihre Zytotoxizität in Zellkultur untersucht. Die wenig zytotoxisch wirkenden Verbindungen wurden anschließend in virologischen Untersuchungen zur Hemmung der Vermehrung und Ausbreitung hochpathogener Viren der klassischen Geflügelpest (H7N1) eingesetzt. Dabei wurde nachgewiesen, dass unter anderen die Inhibitoren 17 und 4-(Guanidinomethyl)phenylacetyl-RVR-4-(amidino)benzylamid (40) die Virusvermehrung effektiv hemmen. Die quantitative Bestimmung infektiöser Viren in Zellkulturen über einen Zeitraum von mehreren Tagen zeigte, dass die Zugabe des Inhibitors 40 zu einer signifikanten Verlangsamung der Virusausbreitung führt. So betrug der Virustiter nach 45 h nur 1,7 % der Kontrollkultur ohne Inhibitor. Zur Optimierung der Reinigung von rekombinant hergestelltem Furin für Kristallisationsexperimente wurden basierend auf der Leitstruktur N-terminal biotinylierte Inhibitoren für die Affinitätschromatographie synthetisiert. Diese Verbindungen wurden in Zusammenarbeit mit der AG Than (Institut für Altersforschung, Fritz Lipmann-Institut, Jena) für die Reinigung von Maus-Furin eingesetzt, indem kommerziell erhältliche Streptavidinsäulen mit den biotinylierten Inhibitoren beladen wurden. Mit diesen Affinitätssäulen gelang eine effektive Reinigung des Furins im Vergleich zu den bisher verwendeten, klassischen Reinigungsmethoden. Die im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten, niedermolekularen Verbindungen sind die wirksamsten, reversibel bindenden Furinhemmstoffe, die bisher weltweit entwickelt wurden. Sie sind daher für weiterführende Untersuchungen in Zellkulturen oder gegebenenfalls sogar in Tiermodellen geeignet.

Summary:
In the present work, novel effective peptidomimetic Inhibitors for the proprotein convertase furin were synthesized and characterized. Several compounds were designed based on the structure of the irreversible inhibitor Decanoyl-RVKR-chloromethyl ketone, which contain in place of the P1 Arg-chloromethyl ketone moiety decarboxylated arginin- or lysin derivatives as well as some other basic groups. Initially, the decanoyl residue was replaced with an acetyl or phenylacetyl group and the lysin in P2-position was replaced with and arginin. Following the synthesis, the determination of the inhibitor constants showed that the compound Phenylacetyl-RVR-4-(amidino)benzylamide (17) was a highly effective Inhibitor (0.81 nM). For optimization, different series of inhibitors were synthesized based on this lead structure 17. Therefore, natural and unnatural amino acids and amino acid derivatives were inserted successively in all other positions (P2-P5). It could be shown that the exchange of the P4-arginin as well as the elimination of the basic group in P2 position led to a drastic reduction of the inhibitory efficiency. The systematic incorporation of all proteinogenic amino acids in P3 position led to compounds which could inhibit furin comparable to inhibitor 17. Besides valin, isoleucin, phenylalanin or tyrosin are also well suited in this position. In contrast, the determination of the inhibitory constants of compounds with acidic amino acids in P3-position showed a reduced inhibitory potency, probably due to electrostatic repulsion from the negatively charged active site of furin. Different fatty acids were introduced in P5 position in course of the following synthesis. The determination of the inhibitory constants showed that up to a length of 10 carbon atoms the inhibitory activity was comparable to the lead structure. The further prolongation of the carbon chain led to a gradual loss of the inhibitory efficiency. The introduction of basic residues in P5 position yielded highly potent Inhibitors of which 3-(Guanidinomethyl)phenylacetyl-RVR-4-(amidino)benzylamide (38) inhibits Furin most efficient with a Ki-value of 5.6 pM. In further course of the work, the stability of some synthesized compounds was analyzed via HPLC. Under the applied conditions no degradation or decay of the chosen compounds could be observed. For example, inhibitor 17 was stable in aqueous solution over 10 days at room temperature. In collaboration with the Garten laboratory (Institute of Virology, University of Marburg) some compounds were tested in cell culture for cytotoxicity. The inhibitors with negligible cytotoxic effects were further used in virological assays for the determination of the inhibition of virus spread and proliferation of highly pathogenic avian influenza (H7N1). Among others, inhibitor 17 and 4-(Guanidinomethyl)phenylacetyl-RVR-4-(amidino)benzylamide (40) were able to reduce efficiently the virus proliferation. The quantitative determination of infectious viruses in cell cultures over a period of several days showed a significant reduction in virus spread. After 45 h, the virus titer reached a value of only 1.7 % in comparison to the control without inhibitor. To purify recombinant synthesized furin for utilization in crystallization experiments, some N-terminally biotinylated inhibitors based on the lead structure were synthesized for the application in affinity chromatography. These derivatives were used in collaboration with the workgroup of Mr. Than (Institute for Age Research, Fritz Lipmann-Institut, Jena) for the purification of mouse furin. Therefore, commercially available streptavidin columns were loaded with the biotinylated compounds. In comparison to the classical purification methods, these affinity columns were well suited for an effective purification of furin. The small molecular inhibitors synthesized during this work are the most efficient reversible furin inhibitors worldwide until today. Therefore, they are well suited for further tests in cell cultures or even in animal models.


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