Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg

Titel: Kristallstrukturen mit kleinen Sondenmolekülen: Ausleuchten von Bindetaschen, Startpunkt für ein Fragment-basiertes Wirkstoffdesign und Erhalten von Phaseninformationen zur Strukturlösung
Autor: Behnen, Jürgen
Weitere Beteiligte: Klebe, Gerhard (Prof.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0076
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0076
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-00767
DDC: 500 Naturwissenschaften
Titel(trans.): X-ray Crystallography of Proteins with Fragments: Experimental Active Site Mapping as a Starting Point in Fragment-based Lead Discovery and 3D-Structure Determination via SAD-Phasing

Dokument

Schlagwörter:
IspD, Fragmentbasierte Leitstrukturentwicklung, FBLD, X-ray crystallography, Xenon, SAD-Phasing, SAD-Phasing, Proteinkristallographie, IspD

Zusammenfassung:
Im Zuge dieser Doktorarbeit wurden unterschiedliche Bereiche behandelt, in denen die Proteinkristallographie wichtige Beiträge liefert. Angefangen bei der de novo Strukturaufklärung von Makromolekülen über Fragmentscreening mittels Röntgenstrukturanalyse bis hin zur strukturbasierten Entwicklung neuer Leitstrukturen im Kampf gegen Malaria und Tuberkulose. Der Schwerpunkt dieser Arbeit befasste sich mit der Suche nach Sondenmolekülen, die sich eignen, um Bindetaschen verschiedne Proteinsysteme experimentell über Röntgenstrukturanalyse auszuleuchten. Diese experimentell charakterisierten Bindungsstellen in Proteinbindetaschen werden auch als HotSpots bezeichnet. Sie stellen die Grundlage dar, um einen proteinbasierten Pharmakophore abzuleiten. Über Soaking und Co-Kristallisation wurde versucht, sehr kleine, hydrophile Moleküle in die Bindetasche der Zielproteine hinein diffundieren zu lassen. Bis zum heutigen Zeitpunkt sind 25 Fragmente und Gase unterschiedlicher Größe und Eigenschaften an dem Proteinsystem TLN mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse vorab durchgemustert worden. Es konnten das Bindungsverhalten von Anilin, 3-Bromphenol, 2-Bromessigsäure, 1,2-Propandiol, Harnstoff, N-Methylharnstoff und N2O im aktiven Zentrum von TLN charakterisiert werden. Diese an TLN erfolgreich etablierten Sondenmoleküle wurden auf andere Proteinsysteme übertragen. Im aktiven Zentrum von PKA konnten jeweils zwei Moleküle Phenol und N-Methylharnstoff sowie in der Bindetasche von DXI und IspD jeweils ein 1,2-Propandiolmolekül charakterisiert werden. Diese experimentell ermittelten HotSpots wurden im Anschluss mit theoretisch berechneten HotSpots unter Verwendung des Programms DrugScoreHotSpot verglichen. Es konnte in diesem Ansatz gezeigt werden, dass die theoretisch berechneten Vorhersagen von HotSpots in Proteinbindetaschen gut mit den experimentell gewonnenen Erkenntnissen übereinstimmten. Dadurch stellt die Kombination beider Ansätze eine hervorragende Möglichkeit dar, proteinbasierte Pharmakophore zu erstellen und mit Hilfe dieser neue Arzneistoffe zu entwickeln. In Kooperation mit dem Arbeitskreis von Prof. Joel L. Sussman in Rehovot, Israel, gelang es, durch Inkorporation von Xenon in Proteinkristallen von Thermolysin und TcAcetylcholinesterase die 3D-Struktur der jeweiligen Xenonproteinkomplexe über SAD (Single Anomalous Dispersion) an einer hauseigenen Röntgenquelle zu bestimmen. Zusätzlich wurden auch noch die Enzyme Endothiapepsin, TGT und Sap2 mit Xenon derivatisiert. Allerdings war es dabei nur möglich, die Struktur von Endothiapepsin über SAD mit in house gesammelten Daten zu bestimmten. Nichts desto trotz konnte an Hand der Modellsystemen Thermolysin, TcAcetylcholinesterase und Endothiapepsin gezeigt werden, daß die Strukturbestimmung von Proteinen unterschiedlicher Enzymklassen, Größe und Symmetrie mit Hilfe des Edelgases Xenon als Schweratomderivat durch die SAD-Methode anhand von in house gesammelten Daten eine einfache, toxikologisch unbedenkliche und leicht durchzuführende Alternative zu herkömmlichen Methoden, wie z.B. Quecksilber- oder Selenmethioninderivaten, darstellt. Als drittes und letztes Thema der Arbeit wurde am Beispiel des Enzyms 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-4-phosphat-synthase (IspD) versucht, eine neue Leitstruktur gegen Malaria und Tuberkulose zu entwickeln. Basis war hier eine Kristallstruktur mit dem Fragment 1,2-Propandiol in der Bindetasche. Über einen Thermofluoro-Assay und mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse wurde versucht, ein zum Cytidin basenanaloges Molekül zu finden, welches in die Basentasche von IspD binden sollte. Das Ziel dabei war es, beide Fragmente passend miteinander zu verbinden, um so eine neue hochpotente Leitstruktur gegen Malaria und Tuberkulose zu erhalten. Obwohl die Apo-Struktur von IspD bekannt ist, war es nötig neue, reproduzierbaren und für Diffraktionsexperimente tauglichen IspD-Kristallen zu finden. Hierfür wurden weit mehr als 1000 verschieden Kristallisationsbedingungen getestet. In einer Feinabstimmung der anfänglich gefunden Bedingungen ließen sich reproduzierbare und ausreichend streuende Kristalle erhalten. Das Streuverhalten von in house vermessenen IspD-Kristallen konnte von einer anfänglichen Auflösung von 4,0 Å bis hin zu 2,34 Å verbessert werden. Zusätzlich wurde das bestehende Expressions- und Reinigungsprotokoll bezüglich der Ausbeute an IspD weiter verbessert. Die Ausbeute an IspD konnte von 135 mg auf 208 mg IspD pro 4 l Ansatz gesteigert werden. Durch einen Thermofluoro-Assay wurden bisher 24 entweder gekaufte oder auch hauseigene Substanzen durchgemustert, um eine Vorauswahl an Fragmenten für die Röntgenstrukturanalyse zu finden. Bei diesen Messungen kristallisierten sich die 6 Liganden mit einer Schmelzpunktverschiebung von 2° – 7,5° C als sehr vielversprechend heraus. Es ist außerdem gelungen die erste substratunabhängige IspD-Komplexstruktur in der PDB zu deponieren.

Summary:
This thesis addresses a variety of different approaches in which structure based drug design plays an important role. Starting with de novo structure determination of macromolecules, followed by fragment screening via X-ray crystallography and finally the structure based lead discovery against malaria and tuberculosis. The emphasis of this thesis was to find small, soluble molecules which mark not only the position of functional groups but also the putative scaffold position, i.e. an aromatic ring system, to create a protein-based pharmacophore. Furthermore, the active sites mapped by this experimental approach can be used as a reference to develop and validate in silico methods to calculate hotspots of binding, such as implemented in the program DrugScore. In this study a selection of different small and highly soluble molecules with a molecular weight of 67 – 297 g/mol were either soaked or co-crystallized in varied concentrations into crystals of different protein targets and subsequently screened by X-ray crystallography. Complexes of TLN, PKA, DXI and IspD with phenol, aniline, urea, N-methylurea and 1,2-propanediol could be determined. Furthermore, it could be evidenced that the positions of the functional groups and ring systems of these molecules were well in agreement with most in silico hotspot predictions calculated by the program DrugScore. The relevance of the observed probe molecule poses for drug binding could be confirmed by superimposing much larger ligands for which complex crystal structures have been determined. It was possible to match not only the position of the functional groups by the found molecular probes but also parts of the scaffold of the larger ligands. The fact that small molecular probes can still be discovered as kind of original seeds from which an entire inhibitor can be grown, opens a very promising and prospective option using the binding of such small probes as a starting point of a fragment-like de novo design. Furthermore, molecular probes such as phenol, aniline, urea, N-methylurea and 1,2-propanediol seemed to be suitable to be applied rather general to many proteins to perform an experimental binding site mapping. Particularly, if they are used in parallel and are further supported by computer tools such as DrugScore to fully map the binding pocket for a subsequent inhibitor design. In collaboration with the group of Prof. Joel L. Sussman in Rehovot, Israel it was possible to incorporate xenon under pressure into crystals of TLN and TcAChE and perform successfully phase determinations via SAD, with in-house data. In addition, further enzymes as EP, TGT and Sap2 were also derivatize with xenon. Unfortunately, only the 3D-structure of EP could be determined additionally to TLN and TcAChE by the SAD method with in-house data. Nevertheless, with the help of TLN, EP and TcAChE as model systems it could be demonstrated on one hand that single (TLN & EP) or double (TcAChE) bound xenon atom is sufficient to produce interpretable density maps, using various programs and program combinations for processing, scaling, phasing and model building and on the other that xenon SAD phasing, using data collected on a home source, may provide an effective, efficient and low-cost alternative to MAD phasing at synchrotron sources. The last topic of this thesis was to discover a new lead structure against malaria and tuberculosis by inhibiting IspD, an enzyme of the non-mevalonat pathway. On the basis of the X-ray structure of IspD in complex with 1,2-propanediol it was attempt to create a new lead by linking this core fragment with an other substrate analogous fragment. Therefore a thermofluoro assay and X-ray crystallography was used for screening purposes. Even the 3D-structure of IspD was known new crystallographic conditions needed to be found, which allow exhaustingly screening via soaking. In the development of new reproducible crystallization conditions and by performing the thermofluoro assay a high amount of soluble protein was required. Therefore the existing purification protocol was been amended and the yield rate could be enhanced from 134 mg up to 203 mg soluble protein out of 4 l bacteria culture. By finding new crystallization terms over 1000 different conditions have been tested. Finally, the diffraction pattern of IspD crystals could be improved from a starting resolution of 4 Å up to 2.34 Å using an in house X-ray source. Although six different fragments were found in the thermofluoro assay, but up to now it was not possible to detect one of these potential fragments in the binding site of IspD. Nevertheless, it was possible to deposit the crystal structure of IspD in complex with 1,2-propanediol in the PDB. This crystal structure is the first non substrate analogous complex structure of IspD in the PBD.


* Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten