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Titel: Regulation of secretion of the signalling protease PopC in Myxococcus xanthus
Autor: Konovalova, Anna
Weitere Beteiligte: Søgaard-Andersen, Lotte (Prof.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0074
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0074
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-00745
DDC: Naturwissenschaften
Titel(trans.): Regulation der Sekretion der signalling Protease PopC in Myxococcus xanthus

Dokument

Schlagwörter:
Sekretion, Signal, Protease, Myxococcus xanthus, Entwicklung, Secretion, Signaling, Protease, Bakterien, Bacteria, Development

Summary:
In response to starvation Myxococcus xanthus initiates a developmental program that culminates in fruiting body formation. Completion of this developmental program depends on cell-cellcommunication involving at least two intercellular signals, the A-signal and the C-signal. The contact-dependent intercellular C-signal function to induce and coordinate the two morphogenetic events in fruiting body formation, aggregation and sporulation, temporally and spatially coordinated. The intercellular C-signal is a 17 kDa protein (p17), which is generated by proteolytic cleavage of the full-length 25 kDa csgA protein (p25), and is essential for fruiting body formation. p25 and PopC, the protease that cleaves p25, accumulate in the outer membrane and cytoplasm, respectively in vegetative cells. PopC is specifically secreted during starvation. Therefore, restriction of p25 cleavage to starving cells depends on a compartmentalization mechanism that involves the regulated secretion of PopC in response to starvation. In this report, the main focus is on understanding the mechanism underlying regulated secretion of the PopC protease. We first focused on the identification of proteins required for PopC secretion. PopC lacks a signal peptide and is secreted in an unprocessed form. We report that two incomplete type III secretion systems, a type VI secretion system and type I secretion systems are not involved in PopC secretion. From a collection of mutants generated by random transposon mutagenesis and unable to complete fruiting body formation, we identified seven mutants unable to secrete PopC. None of the insertions were in genes coding for known secretion systems. The mutations were divided into three classes based on the insertion sites. The class I mutation was in a gene cluster largely encoding proteins of unknown function, predicted to localize to the cell envelope, and with a narrow phylogenetic distribution except for a D,D-carboxypeptidase and two Ser/Thr kinases. The class II mutations were in two clusters encoding paralogous proteins of unknown function predicted to localize to the cytoplasm. Several of the class II genes are phylogenetically widely distributed and frequently present in gene clusters linked to genes encoding secretion systems. We speculate that the class I mutation affect a novel type of secretion system involved in PopC secretion and that the class II mutations either affect proteins with accessory or regulatory functions in PopC secretion. Next, we focused on elucidating the molecular mechanism underlying the activation of PopC secretion in response to starvation. Our data demonstrate that PopC secretion is controlled at the post-translational level by a regulatory cascade involving the RelA and PopD proteins. Specifically, RelA is required for activation of PopC secretion in response to starvation and PopD, which is encoded in an operon with PopC, interacts directly with PopC and acts as an inhibitor of PopC secretion. On the basis of genetic and biochemical data we suggest that PopC and PopD form a cytoplasmic complex that blocks PopC secretion in the presence of nutrients. In response to starvation, RelA is activated resulting in induction of the stringent response. Activated RelA by an unknown mechanism induces the proteolytic degradation of PopD in the PopC/PopD complex in that way releasing PopC for secretion. On the basis of these data, we suggest that the generation of p17 depends on a two-step proteolytic cascade involving degradation of PopD and, subsequently, the specific cleavage of p25 by PopC. The current model for intercellular A-signaling in M. xanthus proposes that starvation induces the release of extracellular A-signal proteases. These proteases are thought to cleave surface-exposed proteins and extracellular proteins thereby generating the A-signal amino acids and peptides, which serve to measure the density of starving cells early during development. DNA microarray analyses (S. Wegener-Feldbrügge, unpubl.) previously suggested that the primary defect in the asgA and asgB mutants, which are unable to generate the A-signal, is not a reduced capacity in protein secretion but a reduced expression of genes encoding secreted proteases including popC. Here, genetic analyses demonstrated that restored expression of popCD rescues development of asgA and asgB mutants without restoring A-signaling. Thus, ectopic expression of popCD leads to a bypass of the requirement for the A-signal during development. We suggest that the inability of asgA and asgB mutants to undergo development is the result of at least two defects: (i) reduced expression of the genes encoding the A-signal proteases; and, (ii) reduced expression of the popC gene.

Zusammenfassung:
Unter Nährstoffmangel initiiert Myxococcus xanthus ein Differenzierungsprogramm, das die Bildung von multizellulären Fruchtkörpern ermöglicht. Der Ablauf dieses Programms ist abhängig von interzellulären Kommunikationsprozessen und involviert mindestens zwei interzelluläre Signale, das A-Signal und das C-Signal. Das Zellkontakt-abhängige C-Signal induziert und koordiniert die für die Fruchtkörperbildung essentiellen morphogenetischen Prozesse der Aggregation und Sporulation, sowohl räumlich als auch zeitlich. Dieses Signal ist ein 17 kDa Protein (p17), das aus der proteolytischen Spaltung des 25 kDa CsgA-Proteins (p25) hervorgeht, und ist essentiell für die Fruchtkörperbildung. p25 und PopC, die Protease die p25 spaltet, akkumulieren unter vegetativen Bedingungen in der äußeren Membran bzw. im Zytoplasma. Unter Nährstoffmangelbedingungen kommt es dann zu einer spezifischen Sekretion von PopC. Dieser Mechanismus der Kompartimentalisierung garantiert, dass eine Spaltung von p25 nur in hungernden Zellen erfolgen kann. Der Hauptschwerpunkt dieser Arbeit betrifft die Mechanismen, die der regulierten Sekretion der Protease PopC zugrunde liegen. Zunächst galt es die Proteine zu identifizieren, die für die PopC Sekretion benötigt werden. PopC verfügt über kein Signalpeptid und wird in einer nicht-prozessierten Form sekretiert. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass weder zwei unvollständige Typ-III-, noch ein Typ-IV noch ein Typ-I Sekretionssystem an der Sekretion von PopC beteiligt sind.Aus einer Sammlung von Mutanten, die durch zufällige Transposon-Insertionen entstanden sind und keine Fruchtkörper mehr bilden können, wurden sieben Mutanten identifiziert, in denen keine PopC Sekretion mehr stattfand. Keine der dazugehörigen Insertionen waren in Genen lokalisiert, die für bekannte Sekretionssysteme kodieren. Basierend auf den entsprechenden Insertionspositionen wurden drei Klassen definiert:Die Mutation der ersten Klasse war in einem Gencluster lokalisiert, dass überwiegend Proteine unbekannter Funktion kodiert. Diese Proteine lokalisieren vermutlich in der Zellhülle und zeigen, mit der Ausnahme von einer D,D-Carboxypeptidase und zwei Ser/Thr Kinasen, eine eingeschränkte phylogenetische Verbreitung. Die zweite Klasse von Mutationen fand sich in zwei Genclustern, die paraloge Proteine mit unbekannter Funktion kodieren. Bei diesen Proteinen handelt es sich vermutlich um zytoplasmatische Proteine. Viele Gene dieser 2. Klasse sind phylogenetisch weit verbreitet und finden sich oftmals in Genclustern, die sich in Nachbarschaft mit Sekretionssystem-kodierenden Genen befinden. Wir nehmen an, dass die Klasse 1 Mutation ein neuartiges Sekretionssystem beeinflusst, dass an der PopC Sekretion beteiligt ist. Wir vermuten außerdem, dass die Klasse 2 Mutationen Proteine beeinflussen, die akzessorische oder regulatorische Funktionen bei der PopC Sekretion einnehmen. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf dem Mechanismus, mit dem die PopC Sekretion unter Nährstoffmangelbedingungen aktiviert wird. Die vorliegenden Daten demonstrieren, dass die PopC Sekretion auf post-translationaler Ebene durch eine regulatorische Kaskade kontrolliert wird, an der die Proteine RelA und PopD beteiligt sind. Dabei wird RelA für die Aktivierung der PopC Sekretion unter Nährstoffmangelbedingungen benötigt, und PopD, dessen Gen zusammen mit popC in einem Operon exprimiert wird, interagiert direkt mit PopC und fungiert dabei als Inhibitor der PopC Sekretion. Auf der Basis genetischer und biochemischer Daten vermuten wir, dass in der Anwesenheit von Nährstoffen PopC und PopD einen zytoplasmatischen Komplex bilden, der eine PopC Sekretion unterbindet. Unter Nährstoffmangel kommt es zu einer RelA-abhängigen Induktion der stringenten Antwort. Durch diese stringente Antwort wird durch einen noch nicht geklärten Mechanismus die proteolytische Degradation von PopD innerhalb des PopC/PopD Komplexes initiiert, wodurch PopC für eine anschließende Sekretion freigesetzt wird. Auf der Basis dieser Daten scheint die Bildung von p17 von einer zweischrittigen proteolytischen Kaskade abzuhängen; zunächst erfolgt eine Degradation von PopD und später die spezifische Spaltung von p25 durch PopC. Das gegenwärtige Modell des interzellulären A-Signals in M. xanthus basiert auf der Annahme, dass unter Nährstoffmangel extrazelluläre A-Signal Proteasen freigesetzt werden. Diese Proteasen sollen dann sowohl Oberflächenproteine als auch extrazelluläre Proteine spalten und dadurch die A-Signal Aminosäuren und Peptide freisetzen, die den Zellen als Sensor der Populationsdichte dienen. DNA-Mikrochip-Analysen (S. Wegener-Feldbrügge, nicht veröffentlicht) ließen vermuten, dass der primäre Defekt von asgA- und asgB-Mutanten, die kein A-Signal bilden können, nicht in einer reduzierten Protein Sekretion begründet ist, sondern auf eine reduzierte Expression von Genen, die Proteasen u. a. auch PopD kodieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass nur durch die wiederhergestellte Expression von popCD die Differenzierungsdefekte von asgA- und asgB-Mutanten aufgehoben werden können, und zwar ohne gleichzeitige Bildung des A-Signals. Die ektopische Expression von popCD umgeht somit während der Differenzierungsphase die A-Signal Abhängigkeit. Wir vermuten, dass die Differenzierungsdefekte der asgA- und asgB-Mutanten daher zwei Gründe haben: (i) eine reduzierte Expression von Genen, die A-Signal Proteasen kodieren, und (ii) eine reduzierte Expression des popC Gens.


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