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Titel: Strukturaufklärung Ribosomaler Komplexe mittels Kryo-EM Mechanismus der Translokationsreaktion ribosomal verankerte ncRNAs
Autor: Ratje, Andreas Heinrich
Weitere Beteiligte: Hartmann, Roland K. (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0065
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0065
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-00652
DDC: Naturwissenschaften
Titel(trans.): Structure Elucidation of Ribosomal Complexes via Cryo-EM- Mechanism of Translocation- ribosomal anchored ncRNAs

Dokument

Schlagwörter:
Translokation, Expression, Ribosom, Ribosome, 23 S rRNA, ncRNA, Translocation, Expression, Elongation cycle, Purification, 23 S rRNA, tRNA, ncRNA, Elongationszyklus, Aufreinigung, tRNA

Zusammenfassung:
Die am Ribosom erfolgende Proteinbiosynthese unterteilt sich in die vier Schritte Initiation, Elongation, Termination und Recycling. Die Elongationsphase als zyklisch ablaufender Vorgang beinhaltet die Anlieferung aminoacylierter tRNAs in die A-Stelle des Ribosoms, die Bildung einer neuen Peptidbindung und die Translokation der tRNAs im Komplex mit der gebundenen mRNA. In Prokaryonten wird die Translokation vom Elongationsfaktor G (EF-G) katalysiert, dessen Aktivität von der Hydrolyse des Kofaktors GTP abhängt. Trotz der Vielzahl der in der Literatur beschriebenen EF-G-Ribosomen-Komplexe und biochemischer Studien ist der genaue Vorgang der Translokation noch unbekannt. Der Beitrag des Elongationsfaktors G, der tRNAs und der verschiedenen Konformationen des Ribosoms zur Translokation ist in molekularen Details noch nicht verstanden worden. Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein Beitrag zum Verständnis dieses Vorgangs geleistet werden. Dazu wurde ein Komplex aus 70S Ribosomen von T. thermophilus mit EF-G und GTP in Gegenwart von Fusidinsäure gebildet und kryo-elektronenmikroskopisch untersucht. Fusidinsäure ermöglicht zwar die für die Translokation benötigte GTP-Hydrolyse, verhindert aber Konformationsänderungen im EF-G und so dessen Dissoziation vom Ribosom. Der kryo-elektronenmikroskopisch gesammelte Datensatz konnte mithilfe des multiparticle refinements in zwei bisher nicht gesehene Konformationen des Ribosoms mit 7,8 °A Auflösung für die erste Subpopulation und 7,6 °A Auflösung für die zweite Subpopulation aufgetrennt werden. Beide Subpopulationen enthalten Elektronendichte für EF-G und eine tRNA, zeigen aber signifikante Unterschiede in ihrer Konformation. Die erste der beiden Subpopulationen zeigt eine Verdrehung (engl. ratcheting) der 30S Untereinheit gegen die große Untereinheit um 7° mit einer gleichzeitigen Drehbewegung des Kopfes (engl. swivelling) ungefähr senkrecht zum ratcheting um 5° relativ zur Körper/Plattform-Region der kleinen Untereinheit. Im Gegensatz dazu ist die 30S Untereinheit in der zweiten der beiden Subpopulationen nur um 4° gegen die große Untereinheit verdreht, der Kopf jedoch um 18° gegenüber der Körper/Plattform-Region gedreht. Die hochaufgelösten Strukturen ermöglichten die Visualisierung von Sekundärstrukturen und die Erzeugung molekularer Modelle mit dem neu entwickelten Algorithmus MDFIT, einem flexiblen Einpassen (engl. docking) von Kristallstrukturen unter Berücksichtigung molekularer Dynamiken. Dabei zeigte sich, dass die Konformation der ersten Subpopulation vergleichbar ist mit der in der Literatur beschriebenen Konformation des PRE-Zustands und dass sich die tRNA in der hybriden Bindung zwischen der P- und der E-Stelle befindet (P/E). Dies führt zu der Annahme, dass es sich bei der ersten Subpopulation um ein pre-translokationales Intermediat (TIPRE) handelt. Die zweite Subpopulation zeigt das Ribosom und die tRNA dagegen in einer neuen Konformation. Der Anticodon-Stem-Loop (ASL) der tRNA hat sich im Vergleich mit dem TIPRE um 8 - 10 °A in Richtung der E-Stelle bewegt, während gleichzeitig der Kontakt mit den P-Stellen-Komponenten des Kopfes der kleinen Untereinheit aufrechterhalten wird, indem die tRNA der starken Drehbewegung des Kopfes folgt. Diese gleichzeitige Interaktion mit P-Stellen-Komponenten des Kopfes und E-Stellen-Komponenten der Körper/Plattform-Region der kleinen Untereinheit kann als hybrides Intermediat innerhalb der 30S Untereinheit angesehen werden. Gleichzeitig bleibt der Kontakt mit der E-Stelle der 50S Untereinheit bestehen, so dass die übliche Nomenklatur zur Bezeichnung der tRNA-Position innerhalb des Ribosoms erweitert werden muss. Die neue hybride Bindung wird als pe/E bezeichnet (P-Stelle auf dem Kopf und E-Stelle auf der Plattform der 30S Untereinheit/E-Stelle auf der 50S Untereinheit). Gemeinsam mit dem gebundenen mRNA Codon kommt der ASL der Position einer komplett translozierten tRNA sehr nahe und diese Konformation einer partiell translozierten tRNA stellt ein post-translokationales Intermediat (TIPOST) auf dem Weg zur vollständigen Translokation dar. Im Gegensatz zu den verdrillten Konformationen der tRNA im TIPRE und TIPOST unterscheidet sich die Grundstruktur des Elongationsfaktors G in beiden Subpopulationen nur unwesentlich. Ein signifikanter Unterschied zeigt sich allerdings in Domäne IV des Faktors, die im TIPOST in Kontakt mit Helix 34 der 16S rRNA tritt. Dieser Kontakt wird ermöglicht, indem EF-G seine Position im Vergleich zum TIPRE leicht verändert hat und Helix 34 der starken Drehbewegung des Kopfes gefolgt ist. Dadurch ändert Helix 34 seine Position um 12 °A und kann nicht mehr mit der Region 530 der 16S rRNA interagieren. Als Folge davon wird der mRNA-Eingangskanal geöffnet und die Translokation des mRNA-tRNA2-Komplexes ermöglicht. Bis jetzt wurden intermediäre Zustände der Untereinheiten-Rotation als Intermediate auf dem Weg zur vollständigen Verdrehung betrachtet. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen jedoch, dass die Bewegung der tRNAs und letztendlich deren Translokation abhängig ist von einer Rückrotation der Untereinheiten und der Drehbewegung des Kopfes der kleinen Untereinheit. Dabei führt die schnelle GTP-Hydrolyse zu einer Destabilisierung der maximalen Untereinheiten-Rotation, da direkte und indirekte Kontakte der switchI-Region von EF-G mit der maximal rotierten 30S Untereinheit beeinflusst werden könnten und eine Rückrotation erleichtern. Im Kontext des Ribosoms, das als brown’sche molekulare Maschine beschrieben werden kann, wirkt EF-G wie eine Sperrklinke, die die Rückrotation der 30S Untereinheit von der Translokation entkoppelt und auf diese Weise die Translokation über mehrere intermediäre Zustände der tRNAs zwischen und innerhalb der Untereinheiten in die klassisch gebundenen Positionen (P/P und E/E) fördert und dirigiert. Die in den letzten Jahren vermehrt entdeckten ncRNAs erfüllen vielfältige biologische Aufgaben und die Kenntnis ihrer dreidimensionalen Struktur ist oftmals ein wichtiger Schritt zum Verständnis ihrer Funktionsweise. Da die meist kleinen ncRNAs nur schlecht den klassischen Strukturanalyseverfahren zugänglich sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine andere Möglichkeit zur Aufklärung der Struktur gesucht. Die Verankerung kleiner RNA-Moleküle auf größeren Molekülen mit bekannter Struktur ermöglicht die Lokalisation der fixierten RNA. Die bei der Kryo-Elektronenmikroskopie eingesetzte Schockgefrierung konserviert zudem die RNA in einem quasi nativen Zustand und verhindert die Bildung von Artefakten, wie sie bei der Kristallbildung für die Röntgenkristallographie auftreten können. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene ncRNAs (RNase P RNA von E. coli, B. subtilis und T. thermophilus, die 6S RNA von A. aeolicus und das Ribozym GIR1 von D. iridis) in unterschiedliche Helices (9, 25, 45 und 98) der 23S rRNA von E. coli insertiert, um die Struktur der jeweiligen ncRNA mittels Kryo-Elektronenmikroskopie zu analysieren. Das 70S Ribosom von E. coli, dessen Struktur weitgehend bekannt ist, wurde dabei als Plattform benutzt. Die Expression mutierter Ribosomen erfolgte in einem hitzeinduzierbarem System mittels Temperaturwechsel auf 42° C in unterschiedlichen E. coli-Stämmen. Die gleichzeitige Expression nativer und mutierter 23S rRNA in diesem hitzeinduzierbaren System erforderte die Abtrennung der mutierten von den nativen Ribosomen. Dies war über den in Helix 98 der mutierten 23S rRNA insertierten MS2 tag möglich. Der über eine RT-PCR geführte Nachweis mutierter Ribosomen verlief im Fall der ncRNAs meist negativ, während sich der MS2 tag schon in cr70S, die eine Mischung nativer und mutierter Ribosomen darstellten, nachweisen ließ. So trugen aufgereinigte Ribosomen zu 100% den MS2 tag in Helix 98, während die zusätzlich insertierte ncRNA kaum oder gar nicht nachweisbar war. Ein deutlicher RT-PCR-Nachweis mutierter Ribosomen, die sowohl den MS2 tag als auch eine ncRNA trugen, gelang nur im Fall der Insertion des Ribozyms GIR1 in Helix 9. Die Induktion durfte allerdings nur über einen Zeitraum von 30 min erfolgen und führte zu einer 10 - 20%igen Expression mutierter 23S rRNA. Die Aufreinigung der cr70S über den MS2 tag in Helix 98 ergab Ribosomen, die zu 100% diesen tag in Helix 98 trugen, aber nur zu 30% das Ribozym GIR1 in Helix 9. Die zusätzliche Insertion in Helix 9, die eventuell die Funktion des Ribosoms beeinträchtigt, wurde durch bisher nicht verstandene Mechanismen auf zellulärer Ebene aus dem Ribosom entfernt. Die kryo-elektronenmikroskopische Analyse der über den MS2 tag aufgereinigten Ribosomen ergab, dass bei etwa 45% der Partikel zusätzliche Elektronendichten sowohl in Helix 9 als auch Helix 98 vorhanden waren. Die Auflösung der erhaltenen Volumenrekonstruktion ist mit 18,4 °A allerdings viel zu niedrig, um eine präzise Interpretation der Struktur des Ribozyms vorzunehmen. Die Voraussetzungen für die Erstellung einer hochauflösenden Struktur, die im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr realisiert werden konnte, sind allerdings erfüllt.

Summary:
Protein biosynthesis is carried out by the ribosome and can be divided into four steps: initiation, elongation, termination and recycling. The elongation phase, a cyclic process, comprises the delivery of aminoacylated tRNAs to the A-site, peptide bond formation and translocation of tRNAs together with bound mRNA. In prokaryotes, translocation is catalysed by elongation factor G (EF-G) in a GTP-dependent manner. The exact mechanism of translocation is still unclear, although many biochemical studies have addressed this functional aspect of translation and high resolution structures of ribosomal complexes containing EF-G have become available. The intricate interplay of EF-G, tRNAs and different conformational states of the ribosome during translocation is far from being fully understood in mechanistic terms. As a result of this PhD work, novel insight into the mechanism of translation has been gained. Starting point was the formation and purification of ribosomal complexes consisting of 70S ribosomes from T. thermophilus bound to EF-G in its GDP form stalled with fusidic acid; the antibiotic allows GTP hydrolysis but inhibits conformational changes of EF-G and dissociation of EF-G from the ribosome. Such particles, further containing a deacylated tRNA, were analyzed by cryo-electron microscopy (cryo-EM). The collected cryo-EM data could be divided by multiparticle refinement into two, as yet undetected subpopulations within EF-G:ribosome complexes with 7.8 Å resolution for the first and 7.6 Å resolution for the second subpopulation. Both subpopulations show density for EF-G and one tRNA, but represent different conformational states. The first subpopulation showed a 50S:30S ratcheting of 7 with a modest swiveling of the 30S head of 5. In contrast, a smaller ratcheting of only 4 is observed for the second subpopulation, but in this case the swivelling of the 30S head is increased to 18. The high resolution of the structures enabled the visualization of secondary structures and the generation of molecular models with the new developed algorithm MDFIT which allows for the flexible docking of crystal structures considering molecular flexibilities. It could be shown that the conformation of the first subpopulation is comparable to ribosomes in the PRE-state, with the tRNA in a hybrid position between P- and E-site (P/E) as described in the literature. Accordingly, this subpopulation has been proposed to represent a pre-translocational intermediate (TIPRE). The second subpopulation shows the ribosome and the tRNA in a new conformation. In comparison with the TIPRE state, the anticodon stem-loop (ASL) has moved about 8 10 °A towards the E-site while maintaining contact with P-site components of the 30S head, enabled by the tRNA following the movement of the head. The simultaneous interaction with P-site components of the 30S head and E-site components of the 30S body/platform is the hallmark of this newly identified intersubunit hybrid site within the small subunit. As the contact with the E-site of the 50S subunit is maintained, the previous nomenclature describing hybrid sites has to be extended. This new tRNA binding state is referred to as the pe/E hybrid position: the tRNA forms P-site contacts with the 30S head and E-site contacts with the 30S platform, while being positioned at the E-site on the 50S side. The ASL together with the bound mRNA is very close to a fully translocated tRNA and the conformation of the partially translocated tRNA is considered to be a post-translocational intermediate (TIPOST). In contrast to the twisted conformations of the tRNA, EF-G shows only slight positional differences within both subpopulations. A significant difference is seen for domain IV of EF-G which gets in contact with helix 34 of 16S rRNA in the TIPOST state. This contact is made possible by a small shift of the position of EF-G and by helix 34 following the movement of the head. The position of helix 34 has changed by 12 °A while interaction with the 530 region of 16S rRNA is disrupted. As a result, the mRNA entry channel is opened and translocation of the mRNA-tRNA2-complex is enabled. So far, intermediate states of inter-subunit rotation were considered to be intermediates on the pathway to the fully rotated state. The present findings show that movement of tRNAs and translocation is dependent on back-ratcheting of the subunits and swiveling of the 30S head. We propose that fast GTP hydrolysis influences the interaction of the switch I region of EF-G with the 30S subunit, leading to a destabilization of the fully ratcheted state to enable back rotation. Based on the model of the ribosome acting as a Brownian ratchet machine during translocation, EFG is suggested to act as a dynamic pawl, decoupling the unratcheting motions of the ribosome from the transition of hybrid state tRNAs back into their classical states. Thereby, EF-G provides directionality and accelerates translocation of the tRNAs via several intermediate inter- and intra-subunit hybrid states into the classical P/P and E/E sites of the POST state. The numerous non-coding RNAs (ncRNAs) discovered in recent years exert a plethora of biological functions. The knowledge of their three-dimensional structure is important towards understanding their mode of function. However, many ncRNAs have turned out to be not amenable to X-ray crystallography. Here we pursued the approach to express ncRNAs as part of the 23S rRNA in order to anchor and expose these ncRNAs on the structurally well-characterized ribosomal surface for structural analyses by cryo-electron microscopy. The use of cryo-electron microscopy combined with shockfreezing of the samples preserves the native state of the ncRNA and avoids generation of artefacts as they are possible in X-ray crystallography. Summary 101 Several different ncRNAs (RNase P RNA of E. coli, B. subtilis and T. thermophilus, 6S RNA of A. aeolicus and the ribozyme GIR1 of D. iridis) were covalently linked to distinct helices of 23S rRNA (helices 9, 25, 45 and 98) of E. coli to elucidate the structure of the inserted RNA molecule using the 70S ribosome as a platform of known structure. Expression of mutated ribosomes was explored in different E. coli strains using a heat-inducible promoter system. This approach required to separate the simultaneously expressed native ribosomes from the mutant ones. This was possible by purification via an MS2 tag which was inserted into helix 98 of mutated ribosomes. Using RT-PCR, it was impossible in most cases to detect significant levels of 23S rRNA carrying the ncRNA insertion, while detection of the MS2 tag was always possible in cr70S fractions representing a mixture of native and mutated ribosomes. Ribosomes purified via the MS2 tag were pure fractions of ribosomes carrying the MS2 tag, but the ncRNA insertions were hardly or not at all detectable. A distinct detection of mutant ribosomes carrying both the MS2 tag and the ncRNA was only feasible in the case of the ribozyme GIR1 inserted into helix 9 of 23S rRNA. The corresponding strain had to be induced for only 30 minutes, resulting in expression of mutated 23S rRNA to a level of 10 20% of total cellular 23S rRNA. Affinity purification of corresponding cr70S preparations resulted in ribosomes all carrying the MS2 tag in helix 98, but only 30% also harboured the ribozyme GIR1 in helix 9. In general, the additional insertion in helix 9 seems to disturb the function of the ribosome, leading to excision of the inserted ncRNA and/or degradation of mutant 23S rRNA as part of as yet unknown cellular defense mechanisms. Cryo-EM analysis of affinity-purified ribosomes resulted in a volume with additional density for helix 9 (ribozyme GIR1) and helix 98 (MS2 tag) in 45% of the particle images. The resolution of 18.4 °A achieved so far is too low for a detailed structural interpretation, but provides the basis for the collection of a data set that is sufficient to to generate a high resolution structure.


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