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Titel: Die Rolle von TRPC1 in CA1-Neuronen des murinen Hippocampus
Autor: Kepura, Frauke
Weitere Beteiligte: Homberg, Uwe (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0058
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-00589
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0058
DDC: 500 Naturwissenschaften
Titel(trans.): The role of TRPC1 in CA1 hippocampal neurons of the mouse

Dokument

Schlagwörter:
Patch-clamp, Patch-Clamp, qRT-PCR, Maus, TRPC1, Golgi, qRT-PCR, Golgi, TRPC1, Hippocampus, Mouse

Zusammenfassung:
Die klassischen (classical) "transient receptor potential"-Kanäle (TRPC1-TRPC7) bilden eine Familie von nichtselektiven Kationenkanälen, die Phospholipase C-abhängig aktiviert werden und in verschiedensten Geweben exprimiert werden.(z.B. Chung et al., 2006). Funktionelle Kanäle bestehen aus vier Untereinheiten und die Bildung von homo- bzw. heteromultimeren Kanälen führt zu unterschiedlichen Regulations- und Permeationseigenschaften. Im heterologen System, heteromultimerisiert TRPC1 mit und modifiziert dadurch die Eigenschaften von TRPC4 und TRPC5 (Strübing et al., 2001). In CA1 hippocampalen Neuronen werden TRPC1, TRPC4 und TRPC5 koexprimiert und in diesen Neuronen induziert die Aktivierung von Gq-koppelnden Rezeptoren einen Ca2+-abhängigen nichtselektiven Kationenstrom (ICAN; Congar et al., 1997). Es wird vermutet, dass TRPC-Kanäle an der Vermittlung des ICAN beteiligt sind, der Nachweis hierfür fehlt jedoch bis heute. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb, zum einen die Charakteristika des Stroms zu beschreiben, der durch die Stimulation von metabotropen Glutamatrezeptoren (mGluRI) mittels (RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycin (DHPG) in CA1-Neuronen des Hippocampus aktiviert wird. Zum anderen sollte die Rolle von TRPC1 bei der Vermittlung dieses Stromes analysiert werden, indem die Antworten zwischen Wildtyp- (WT) und homozygoter TRPC1-Knockoutmaus (TRPC1-/-) verglichen werden. TRPC1-/- Mäuse weisen keinen offensichtlichen Phänotyp auf (Dietrich et al., 2007) und die grobe Morphologie der hippocampalen Formation ist unverändert. Auf mikroskopischer Ebene zeigten CA1-Neurone der TRPC1-/- Maus, die mittels Golgi-Färbung markiert wurden, eine kleine jedoch signifikante Zunahme der Anzahl an Primärdendriten. Bei der Durchführung von Whole-Cell Voltage-Clamp Experimenten führte die Stimulation von mGluRI zur Generierung eines Stromes sowohl im WT als auch in der TRPC1-/- Maus. Die Strom-Spannungsbeziehung des DHPG-sensitiven Stroms war S-förmig (Min: -50 mV, Max: +40 mV, Umkehrpotential: -10 mV). Der Einwärtsstrom wurde durch extrazelluläre Kationen (Na+, Ca2+) getragen und durch die intrazelluläre Ca2+- und extrazelluläre Mg2+-Konzentration moduliert. Eine Besonderheit des ICAN war seine Spannungsabhängigkeit, da er ohne eine vorherige Depolarisation der Membran nicht induziert werden konnte und somit als Integrator von Rezeptoraktivierung und Membrandepolarisation fungierte (Koinzidenz). Der Hauptunterschied zwischen WT- und TRPC1-/- Maus war die signifikante Zunahme des Einwärtsstroms in Neuronen der TRPC1-/- Maus. Des Weiteren ergaben die durchgeführten Versuche, dass es erst zwei Wochen postnatal zu der beobachteten Zunahme des Stroms in der Knockoutmaus kam. Der Stromzuwachs resultierte nicht aus einer kompensatorischen Veränderung der Expression anderer TRPC-Isoformen in Neuronen der TRPC1-/- Maus. Die Analyse der Expressionslevel einzelner TRPC-Isoformen mithilfe der Isolation von mRNA aus hippocampalem Gewebe und qRT-PCR zeigte, dass das Vorkommen der Isoformen - mit Ausnahme von TRPC1 - vergleichbar war zwischen WT- und TRPC1-/- Maus. Um die physiologische Konsequenz des gesteigerten DHPG-sensitiven Einwärtsstroms in der TRPC1-/- Maus zu untersuchen, wurden Whole-Cell Current-Clamp Experimente durchgeführt. CA1-Neurone im WT und in der TRPC1-/- Maus wiesen ein vergleichbares Ruhemembranpotential auf. Die Stimulation von mGluRI im WT rief hauptsächlich eine schwache Zelldepolarisation und die Ausbildung bzw. Steigerung von Spikeaktivität hervor. Im Gegensatz dazu zeigten Neurone in der TRPC1-/- Maus induziert durch die Stimulation mit DHPG eine stärker ausgeprägte Depolarisation und eine größere Anzahl der Zellen, die sogenannte epilepsieartige Aktivität mit der Ausbildung von Plateaupotentialen (PP) aufwiesen. Eine schwache Strominjektion in der Anwesenheit des mGluRI-Agonisten erzeugte in Neuronen des WT entweder eine langsame Nachdepolarisation oder eine starke Depolarisation, die mit der Ausbildung von PP mit einer Dauer von bis zu 55 s nach Beendigung der Strominjektion einherging. Zusätzlich zu diesen Antworten zeigten Neurone in der TRPC1-/- Maus häufiger PP vergleichbar zum WT, jedoch signifikant kürzer in ihrer Dauer. Die dargestellten Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass TRPC1 eine negativ-regulatorische Funktion in CA1 hippocampalen Neuronen übernimmt. Hierbei reduziert TRPC1, vermutlich durch die Bildung von heteromultimeren Kanälen mit TRPC4 und TRPC5, den nichtselektiven Kationeneinstrom, der durch die Stimulation von mGluRI aktiviert wird. Die Deletion von TRPC1 führt zu einer gesteigerten Anzahl der Neurone, die in Antwort auf eine Membrandepolarisation bei gleichzeitiger Aktivierung von mGluRI mit der Entwicklung von PP reagieren. Da PP in die Ausbildung epilepsieartiger Aktivität involviert sind, scheint die physiologische Rolle von TRPC1 eine Modulation der Zellerregbarkeit in CA1 hippocampalen Neuronen zu sein.

Summary:
The classical or canonical "transient receptor potential" channels (TRPC1 - TRPC7) are a family of nonselective cation channels, that are activated in a phospholipase C-dependent manner and are expressed in many tissues, e. g. the brain (cortex, hippocampus, etc.; e. g. Chung et al., 2006). TRPC channels are thought to be tetrameric, and the assembly of different TRPC subunits into homo- and heteromultimers creates channels with different regulatory and physiological properties. In heterologous expression systems, TRPC1 heteromultimerizes with and modifies the properties of TRPC4 and TRPC5 (Strübing et al., 2001). In CA1 hippocampal neurons TRPC1, TRPC4 and TRPC5 are coexpressed and in these neurons, the activation of Gq-coupled receptors induces a Ca2+-activated nonselective cation current (ICAN; Congar et al., 1997). TRPC channels have been suggested to be involved in the generation of this current, but there is little hard evidence to support this. Therefore, the aim of this thesis was to characterize the properties of the cation current activated by stimulation of metabotropic glutamate receptors of type I (mGluRI) by (RS)-3,5-dihydroxyphenylglycine (DHPG) in CA1 neurons of the murine hippocampus and to study the role of TRPC1 in the generation of this current by comparing the responses from wild type (TRPC1+/+) and homozygous TRPC1 knockout mice (TRPC1-/-). TRPC1-/-mice show no obvious phenotype (Dietrich et al., 2007), and the morphology of the hippocampus is largely unchanged. At the microscopical level, Golgi-stained CA1 neurons showed a small but significant increase in the number of primary branches. In whole-cell voltage-clamp recordings, the stimulation of mGluRI led to the development of a current in WT as well as in TRPC1-/- mice. The current-voltage relationship of the DHPG-sensitive current was S-shaped with a minimum at around -50 mV, a maximum at +40 mV and a reversal potential near -10 mV. The inward current was carried by extracellular cations like Na+ and Ca2+ and was modulated by the intracellular Ca2+ as well as the extracellular Mg2+ concentration. Interestingly, the ICAN in CA1 neurons was voltage-dependent. Therefore, the nonselective cation channel required activation of mGluRI and membrane depolarization to be activated, acting as a coincidence detector. The major difference between TRPC1+/+ and TRPC1-/- neurons was a significant increase of the inward current in TRPC1-/- mice. Another finding was that the increase of the inward current in TRPC1-/- mice was detectable two weeks after birth. The larger current in TRPC1-/- mice is unlikely to result from a change in the expression patterns of TRPC isoforms. Expression levels of TRPC mRNAs in the whole hippocampus measured using quantitative real-time PCR were, with the exception of TRPC1, similar in WT and TRPC1-/- mice. To investigate the physiological consequences of the increased DHPG-sensitive inward current in TRPC1-/- mice, whole-cell current-clamp recordings were performed. CA1 neurons from WT and TRPC1-/- mice showed a comparable resting membrane potential. In most experiments, the stimulation of mGluRI in WT induced membrane depolarization leading to the generation of, or an increase in spike activity. In contrast, in TRPC1-/- mice, stimulation by DHPG led to stronger membrane depolarizations and to an increased tendency of these neurons to show so-called epileptiform activity associated with the generation of plateau potentials. In response to small current injections in the presence of the mGluRI agonist, TRPC1+/+ neurons showed a weak slow afterdepolarization or a stronger depolarization to a plateau potential which persisted up to 55 s following the current injection. In addition to these patterns, neurons in TRPC1-/- mice mainly showed plateau potentials similar to that in TRPC1+/+ mice, but with a significantly shorter duration. In conclusion, this study showed that TRPC1 has a negative regulatory role in CA1 hippocampal neurons where it reduces the inward nonselective cation current generated in response to mGluRI stimulation. This probably occurs as an effect of the formation of heteromultimeric channels with TRPC4 and TRPC5. Deletion of TRPC1 results in an increase of the number of neurons developing a plateau potential in response to simultaneous membrane depolarization and mGluRI activation. Since plateau potentials may be involved in the generation of epileptiform activity, the physiological role of TRPC1 may be the modulation of cell excitability in CA1 hippocampal neurons.


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