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Titel: Biogenesis of peroxisomes in mammalian cells: Characterization of the Pex11 proteins and their role in peroxisomal growth and division
Autor: Delille, Hannah Katharina
Weitere Beteiligte: Jacob, Ralf (Prof. Dr. )
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0009
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0009
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-00093
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Peroxisomale Biogenese in Säugerzellen: Charakterisierung der Pex11-Proteine und deren Rolle in Wachstum und Teilung von Peroxisomen

Dokument

Schlagwörter:
Peroxisome, Pex19, Pex19, Fis1, Peroxisom, Peroxisomal biogenesis, Pex11-Proteine, Pex11 proteins, Biogenese, Fis1

Summary:
Peroxisomes are multifunctional organelles involved in various metabolic processes. Peroxisomal malfunctions lead to numerous mostly severe disorders, rendering perox-isomes essential for human health and development. Peroxisomal abundance can be adjusted to the cellular needs, since peroxisomes have the capacity to proliferate or to be degraded. Peroxisomes multiply by growth and division, but can also form de novo via the endoplasmic reticulum. Peroxisomal growth and division is a multistep process involving peroxisome elongation, constriction and final fission. The molecular components and mechanisms mediating the formation, growth, division and dynamics of peroxisomes are far from being understood. Pex11pβ, DPL1 and hFis1 were previously identified as the first molecular components involved in proliferation and division of peroxisomes in mammals. Pex11pβ mediates peroxisome elongation, while hFis1 serves as membrane adaptor for DLP1 responsible for division of the organelles. Surprisingly, DLP1 and hFis1 are involved in both mitochondrial and peroxisomal division. Aim of this study was to further reveal the molecular mechanisms of peroxisomal proliferation and division. First, the dual targeting of hFis1, a tail-anchored protein, was studied. It was demon-strated for the first time that peroxisomal but not mitochondrial targeting of hFis1 de-pends on Pex19p, a peroxisomal import factor. An essential binding region for Pex19p was located within the last 26 C-terminal amino acids of hFis1. The basic amino acids in the very C-terminus are not essential for Pex19p binding and peroxisomal targeting but are instead required for mitochondrial targeting. Since overexpression of Pex19p alone was not sufficient to shift the targeting of hFis1 to peroxisomes, further regulative mechanisms are likely to be involved. The findings indicate that targeting of hFis1 to peroxisomes and mitochondria are independent events and support a direct, Pex19p-dependent targeting of peroxisomal tail-anchored proteins. Furthermore, Pex11pβ and its isoforms Pex11pα and Pex11pγ have been studied. Pex11 proteins are the only proteins known to induce peroxisome elongation and proliferation in mammals, and it is assumed that they are key components in the regulation of peroxisome abundance. In this study, a comparative characterization of the Pex11p isoforms was performed for the first time. Differently tagged and truncated versions were generated and alterations of peroxisome formation and division were monitored. Interestingly, it was shown that the Pex11 proteins have (only) partially overlapping functions. Pex11pβ expression is known to induce formation of tubular peroxisomes, followed by segmentation of the tubules before they are divided by the division machinery. It was demonstrated here that Pex11pγ promotes tubulation of peroxisomes similar to Pex11pβ, but does not induce subsequent segmentation of the peroxisomal tubules. Pex11pα, on the other hand, induces only a segregation of peroxisomal proteins. Thus, Pex11pα and Pex11pγ appear to fulfil different functions, which are combined in Pex11pβ. Furthermore, the Pex11 proteins show different sensitivities to the detergent Triton-X 100, which is likely to be related with different lipid binding properties, which might in turn explain their capacities to deform membranes. Several signals inducing peroxisome elongation (e.g. microtubule depolymerisation) were examined, and it was demonstrated that multiple simultaneous stimuli result in hypertubulation of peroxisomes. The hypertubulation was not mediated by transcriptional upregulation of the Pex11 proteins. This additive effect indicates that complex regulation and activation mechanisms of the Pex11 proteins exist (e.g. post-translational modifications), and/or that other effectors than Pex11pβ are able to mediate elongation of peroxisomal membranes. Moreover, it was discovered that a Pex11pβ-YFP fusion protein can be used as a specific tool to further dissect the growth and division process at early time points. Pex11pβ-YFP inhibits peroxisomal segmentation and division, but instead results in formation of pre-peroxisomal membrane structures composed out of globular domains and tubular extensions. These structures were characterized in detail. Interestingly, peroxisomal matrix and membrane proteins were targeted to distinct regions of the peroxisomal structures. Performing time-course and import assays, it was shown that Pex11pβ-mediated membrane formation was initiated at the pre-existing peroxisome. This indicates that growth and division of peroxisomes follows a multistep maturation pathway and that formation of mammalian peroxisomes is more complex than simple division of a pre-existing organelle. In this study, the early steps of the peroxisomal growth and division process have been characterized in detail for the first time. The findings give new insights into the general processes of peroxisome formation by growth and division, and indicate the involvement of new, not yet characterized processes (e.g. in protein sorting) at the peroxisomal membrane.

Zusammenfassung:
Peroxisomen sind multifunktionale Zellorganellen, die in eine Vielzahl von metaboli-schen Prozessen involviert sind. Peroxisomale Dysfunktionen führen zu verschiedensten zum Teil schwerwiegenden Erkrankungen. Peroxisomen sind für die Entwicklung und Gesundheit des Menschen essentiell. Die Anzahl der Peroxisomen kann den jeweiligen Anforderungen durch Proliferation oder Degradation der Organellen angepasst werden. Peroxisomen vermehren sich durch Wachstum und Teilung, sie können aber auch de novo aus dem Endoplasmatischen Retikulum gebildet werden. Der Wachstums- und Teilungsprozess besteht aus mehreren Schritten: Elongation, Segmentierung und anschließende Durchschnürung der peroxisomalen Tubuli. Die genauen Mechanismen und molekularen Komponenten der Wachstums- und Teilungsmaschinerie sind noch weitestgehend unbekannt. Die ersten identifizierten Säugerproteine sind Pex11pβ, hFis1 und DLP1. Pex11pβ vermittelt die peroxisomale Elongation, während hFis1 der Membranandapter für DLP1 ist, welches wiederum die Organellen teilt. Interessanterweise sind hFis1 und DLP1 gleichermaßen an der Teilung der Mitochondrien beteiligt. Ziel dieser Arbeit war es nun die molekularen Mechanismen der peroxisomalen Proliferation und Teilung weiter aufzuklären. Zunächst wurde das duale Targeting von hFis1, einem C-terminal verankerten Protein, untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Pex19p, ein peroxisomaler Importfaktor, an hFis1 bindet und das peroxisomale Targeting von hFis1 vermittelt. Pex19p wird hinge-gen nicht für den mitochondrialen Import benötigt. Die Binderegion von Pex19p konnte auf die C-terminalen 26 Aminosäuren eingegrenzt werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass basische Aminosäuren im C-Terminus von hFis1 zwar für den mitochondrialen Import von Nöten sind, der peroxisomale Import und die Bindung von Pex19p erforderte diese Aminosäuren hingegen nicht. Weitere Regulations-mechanismen scheinen zu existieren, da das peroxisomale Targeting von hFis1 nicht mittels Überexpression von Pex19p gesteigert werden konnte. Die erzielten Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass das Targeting von hFis1 zu Peroxisomen und Mitochondrien zwei unabhängige Prozesse sind. Zudem scheinen C-terminal verankerte Proteine direkt und Pex19p-abhängig in die peroxisomale Membran inseriert zu werden. Des Weiteren wurde Pex11pβ sowie dessen beide Isoformen Pex11pα und Pex11pγ untersucht. Pex11-Proteine sind die einzig bekannten Proteine, die im Säuger die Elongation und Proliferation von Peroxisomen induzieren; sie erfüllen daher (vermutlich) eine Schlüsselfunktion in der Regulation der Peroxisomenanzahl. Hier wurde zum ersten Mal eine vergleichende Charakterisierung der Pex11p-Isoformen durchgeführt. Unterschiedlich getaggte und trunkierte Konstrukte wurden generiert und deren Auswirkungen auf die Bildung und Teilung der Peroxisomen untersucht. Bemerkenswert ist, dass die drei Pex11-Proteine (nur) teilweise überlappende Funktionen haben. Durch Pex11pβ induzierte peroxisomale Tubuli segmentieren (bevor sie geteilt werden). Pex11pγ bewirkt ebenfalls die Ausbildung von Tubuli, diese werden allerdings nicht segmentiert. Die Expression von Pex11pα führt hingegen ausschließlich zu einer Segregation der peroxisomalen Proteine. Die beiden unterschiedlichen Funktionen von Pex11pα und Pex11pγ scheinen daher in Pex11pβ vereint zu sein. Zusätzlich zeigen die Pex11-Proteine unterschiedlich starke Sensitivität für das Detergens Triton-X 100, was mit unterschiedlichen Lipid¬binde¬eigen¬schaften zusammenhängen könnte, die wiederum die membran¬deformierenden Fähigkeiten erklären würden. Es wurden zudem unterschiedliche Signale, die zu Elongation von Peroxisomen führen (wie z.B. Mikrotubulidepolymerisation), untersucht und es konnte gezeigt werden, dass multiple Stimuli zu einer Hypertubulation der Peroxisomen führen. Diese wird allerdings nicht durch transkriptionelle Hochregulation der Pex11-Proteine vermittelt. Dies weist darauf hin, dass weitere Proteine eine Elongation von Peroxisomen induzieren können und/oder dass andere regulatorische Prozesse wie z.B. posttranslationale Modifikationen an der Tubulation der Peroxisomen beteiligt sind. Ferner wurde entdeckt, dass das Fusionsprotein Pex11pβ-YFP als spezifisches Werkzeug für die Entschlüsselung früher Ereignisse im Wachstums- und Teilungsprozess der Peroxisomen genutzt werden kann. Pex11pβ-YFP inhibiert die Segmentierung und Teilung der Peroxisomen. Es führt zur Bildung von pre-peroxisomalen Strukturen, die aus globulären Domänen und tubulären Membranfortsätzen aufgebaut sind. Diese Strukturen wurden detailliert charakterisiert. Interessanterweise sind die peroxisomalen Matrix- und Membranproteine in definierten Regionen lokalisiert. Es konnte mit Hilfe von time-course und Importstudien gezeigt werden, dass die von Pex11pβ induzierten Membranfortsätze von schon vorhandenen Peroxisomen ausgehen. Dies zeigt, dass der Wachstums- und Teilungsprozess der Peroxisomen ein mehrschrittiger Reifungsvorgang ist. Die Bildung von Peroxisomen im Säuger ist somit komplexer als die simple Durchschnürung einer existenten Organelle. In dieser Arbeit wurden insbesondere die frühen Schritte des peroxisomalen Wachstums- und Teilungsprozesses erstmals detailliert charakterisiert. Die erzielten Befunde werfen ein neues Licht auf den generellen Prozess der Bildung von Peroxisomen durch Wachstum und Teilung und weisen auf neue, noch nicht charakterisierte Vorgänge (z.B. bei der Proteinsortierung) an der peroxisomalen Membran hin.


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