Dokument

Zusammenfassung:
Von allen Mitgliedern der STAT-Familie ist die Signaltransduktion durch den Trans-kriptionsfaktor STAT1 bislang am besten untersucht, trotzdem sind noch viele Fragen bezüglich des Mechanismus einer effektiven Zielgenaktivierung offen. Insbesondere die molekularen Schritte der Zielgenerkennung, der Rekrutierung von Koaktivatoren und der Regulation der DNA-Bindung sind nur unvollständig verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmalig STAT1-Mutanten generiert, die eine höhere Affinität zu ihren spezifischen palindromischen DNA-Bindestellen (GAS-Stellen) bzw. eine verbesserte kooperative DNA-Bindung aufweisen. Diese DNA-Bindemutanten wurden als nützliche Werkzeuge zum Studium der Zielgenaktivierung eingesetzt. Durch Mutation zweier Glutaminsäurereste in der DNA-Bindedomäne konnte ein molekularer Mechanismus aufgedeckt werden, wodurch phosphorylierte STAT1-Dimere von DNA dissoziieren und damit transkriptionelle Antworten positiv kontrollieren. Beide Aminosäuren kontaktieren das Phosphodiester-Rückgrat der DNA und fungieren als molekularer Schalter, der sequenzunabhängig gebundene Dimere von DNA freisetzt. Durch Einführen von zwei Punktmutationen lässt sich die Dissoziation von DNA inhibieren, dies wirkt sich in einem vergrößerten Repertoire an möglichen Bindestellen auf DNA und einer verstärkten Bindung an hoch-affinen GAS-Stellen aus. Trotz verbesserter GAS-Bindung und einem erhöhten Level an phosphorylierten STAT1-Dimeren im Zellkern ist die transkriptionelle Aktivität nach IFNγ-Stimulation signifikant reduziert. Diese verminderte Genaktivierung erklärt sich zum einen durch unspezifische DNA-Bindung außerhalb von kanonischen GAS-Stellen, zum anderen durch eine verminderte Austauschreaktion an den Promotoren der Zielgene. Eine hohe Dissoziationsrate von DNA ist daher ein Schlüsselfaktor der STAT1-vermittelten Sig-naltransduktion, der erklärt, warum hyperphosphorylierte STAT1-Mutanten mit erhal-tener GAS-Diskriminierung und erhöhter DNA-Bindeaktivität schlechtere Transkriptionsaktivatoren als das Wildtyp-Protein sind. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass eine nukleäre Akkumulation für die Genaktivierung entbehrlich ist. Weiterhin wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Mutationen in der N-Domäne identifiziert, die in einer verbesserten kooperativen DNA-Bindung resultierten. Diese zweite Kategorie von DNA-Bindemutanten mit erhaltener GAS-Diskriminierung zeigt eine differentielle Genaktivierung, deren Transkriptionsrate von der Anzahl und Affinität der im Promotor vorhandenen GAS-Stellen abhängt. Mit Hilfe dieser Mutanten konnten erstmalig die Auswirkungen verbesserter Tetramerstabilisierung auf die transkriptionelle Aktivität untersucht werden. Ein erhöhtes Transkriptionsniveau wurde an Genen mit mehrfachen GAS-Bindestellen beobachtet; die Zielgenaktivierung an einfachen GAS-Stellen durch verbesserte kooperative DNA-Bindung zeigt sich differentiell. Klinische Hinweise darauf, dass solche dysfunktionalen DNA-Bindemutationen von STAT1 krankheitsrelevant sind, konnten in kleineren Stichproben von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie (n=235) und verschiedenen Leukämieentitäten (n=25) nicht gefunden werden.

Bibliographie / References

1. Shuai, K., Liao, J., Song, M.M. (1996) Enhancement of antiproliferative activity of gamma interferon by the specific inhibition of tyrosine dephosphorylation of Stat1.
2. Yang, E., Wen, Z., Haspel, R. L., Zhang, J.J., Darnell, J.E. Jr. (1999) The linker do- main of Stat1 is required for gamma interferon-driven transcription. Mol Cell Biol 19, 5106-5112.
3. Sahni, M., Raz, R., Coffin, J.D., Levy, D., Basilico, C. (2001) STAT1 mediates the increased apoptosis and reduced chondrocyte proliferation in mice overexpressing FGF2. Development 128, 2119-2129.
4. Townsend, P.A., Scarabelli, T.M., Davidson, S.M., Knight, R.A., Latchman, D.S., Stephanou, A. (2004) STAT-1 interacts with p53 to enhance DNA damage-induced apoptosis. J Biol Chem 279, 5811-5820.
5. Marg, A., Meyer, T., Vigneron, M., Vinkemeier, U. (2008) Microinjected antibodies interfere with protein nucleocytoplasmic shuttling by distinct molecular mechanisms. Cytometry A 73A, 1128-1140.
6. Sung, S.-C., Fan, T.-J., Chou, C.-M., Leu, J.-H., Hsu, Y.-L., Chen, S.-T., Hsieh, Y.-C., Huang, C.-J. (2003) Genomic structure, expression and characterization of a STAT5 homologue from pufferfish. Eur J Biochem 270, 239-252.
7. Van de Stolpe, A., Caldenhoven, E., Stade, B.G., Koenderman, L., Raaijmakers, J.A., Johnson, J.P., van der Saag, P.T. (1994) 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-and tumor necrosis factor alpha-mediated induction of intercellular adhesion molecule-1 is inhibited by dexamethasone. Functional analysis of the human intercellular adhesion molecular-1 promoter. J Biol Chem 269, 6185-6192.
8. Su, W.C., Kitagawa, M., Xue, N., Xie, B., Garofalo, S., Cho, J., Deng, C., Horton, W.A., Fu, X.Y. (1997) Activation of Stat1 by mutant fibroblast growth-factor receptor in thanatophoric dysplasia type II dwarfism. Nature 386, 288-292.
9. Shuai, K., Schindler, C., Prezioso, V. R., Darnell, J.E. Jr. (1992) Activation of tran- scription by IFN-γ: tyrosine phosphorylation of a 91-kD DNA binding protein. Science 258, 1808-1812.
10. Starr, R., Willson, T.A., Viney, E.M., Murray, L.J., Rayner, J.R., Jenkins, B.J., Gonda, T.J., Alexander, W.S., Metcalf, D., Nicola, N.A., Hilton, D.J. (1997) A family of cytokine-inducible inhibitors of signalling. Nature 387, 917-921.
11. Podewski, E.K., Hilfiker-Kleiner, D., Hilfiker, A., Morawietz, H., Lichtenberg, A., Wol- lert, K.C., Drexler, H. (2003) Alterations in Janus kinase (JAK)-signal transducers and activators of transcription (STAT) signaling in patients with end-stage dilated cardi- omyopathy. Circulation 107, 798-802.
12. Strehlow, I., Schindler, C. (1998) Amino-terminal signal transducer and activator of transcription (STAT) domains regulate nuclear translocation and STAT deactivation.
13. Meissner, T., Krause, E., Lödige, I., Vinkemeier, U. (2004) Arginine methylation of STAT1: a reassessment. Cell 119, 587-589.
14. Shuai,K., Stark,G.R., Kerr,I.M., Darnell, J.E. Jr. (1993) A single phosphotyrosine re- sidue of Stat91 required for gene activation by interferon-γ. Science, 261, 1744-1746.
15. Shang, Y., Hu, X., DiRenzo, J., Lazar, M.A., Brown, M. (2000) Cofactor dynamics and sufficiency in estrogen receptor-regulated transcription. Cell 103, 843-852.
16. Weber-Nordt, R.M., Egen, C., Wehinger, J. (1996) Constitutive activation of STAT proteins in primary lymphoid and myeloid leukemia cells and in Epstein-Barr virus (EBV)-related lymphoma cell lines. Blood 88, 809-816.
17. Stroschein, S.L., Wang, W., Luo, K. (1999) Cooperative binding of Smad proteins to two adjacent DNA elements in the plasminogen activator inhibitor-1 promoter me- diates transforming growth factor beta-induced smad-dependent transcriptional acti- vation. J Biol Chem 274, 9431-9441.
18. Xu, X., Sun, Y.L., Hoey, T. (1996) Cooperative DNA binding and sequence-selective recognition conferred by the STAT amino-terminal domain. Science 273, 794-797.
19. Schooltink, H., Rose-John, S. (2002) Cytokines as therapeutic drugs. J Interferon Cytokine Res 22, 505-516.
20. Yang, E., Henriksen, M. A., Schaefer, O., Zakharova, N., Darnell, J.E. Jr. (2002) Dis- sociation time from DNA determines transcriptional function in a STAT1 linker mu- tant. J Biol Chem 277, 13455-13462.
21. ducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 3041-3045.
22. Takeda, K., Tanaka, T., Shi, W., Matsumoto, M., Minami, M., Kashiwamura, S., Na- kanishi, K., Yoshida, N., Kishimoto, T. (1996) Essential role of Stat6 in IL-4 signalling. Nature 380, 627-630.
23. Sekimoto, T., Imamoto, N., Nakajima, K., Hirano, T., Yoneda, Y. (1997) Extracellular signal-dependent nuclear import of Stat1 is mediated by nuclear pore-targeting com- plex formation with NPI-1, but not Rch1. EMBO J 16, 7067-7077.
24. Zhu, M., John, S., Berg, M., Leonard, W.J. (1999) Functional association of Nmi with Stat5 and Stat1 in IL-2-and IFNgamma-mediated signaling. Cell 96, 121-130.
25. Zhang, X., Darnell, J.E. Jr. (2001) Functional importance of Stat3 tetramerization in activation of the alpha 2-macroglobulin gene. J Biol Chem 7, 33576-33581.
26. Yan, R., Small, S., Desplan, C., Dearolf, C.R., Darnell, J.E. Jr. (1996) Identification of a Stat gene that functions in Drosophila development. Cell 84, 421-430.
27. Zhao, H., De, B.P., Das, T., Banerjee, A.K. (1996) Inhibition of human parainfluenza virus-3 replication by interferon and human MxA. Virology 220, 330-338.
28. Interferon activation of the transcription factor Stat91 involves dimerization through SH2-phosphotyrosyl peptide interactions. Cell 76, 821-828.
29. Schindler, C., Shuai, K., Prezioso, V.R., Darnell, J.E. Jr. (1992) Interferon-dependent tyrosine phosphorylation of a latent cytoplasmic transcription factor. Science 257, 809-813.
30. Sekimoto, T., Nakajima, K., Tachibana, T., Hirano, T., Yoneda, Y. (1996) Interferon- gamma-dependent nuclear import of Stat1 is mediated by the GTPase activity of Ran/TC4. J Biol Chem 271, 31017-31020.
31. Shimoda, K., van Deursen, J., Sangster, M.Y., Sarawar, S.R., Carson, R.T., Tripp, R.A., Chu, C., Quelle, F.W., Nosaka, T., Vignali, D.A., Doherty, P.C., Grosveld, G., Paul, W.E., Ihle, J.N. (1996) Lack of IL-4-induced Th2 response and IgE class switch- ing in mice with disrupted Stat6 gene. Nature 380, 630-633.
32. Shuai, K. (2000) Modulation of STAT signaling by STAT-interacting proteins. Onco- gene 19, 2638-2644.
33. MacMicking, J., Xie, Q.-W., Nathan, C. (1997) Nitric oxide and macrophage function.
34. Vasilaki, E., Siderakis, M., Papakosta, P., Skourti-Stathaki, K., Mavridou, S., Kardas- sis, D. (2009) Novel regulation of Smad3 oligomerization and DNA binding by its link- er domain. Biochemistry 48, 8366-8378.
35. Marg, A., Shan, Y., Meyer, T., Meissner, T., Brandenburg, M., Vinkemeier, U. (2004) Nucleocytoplasmic shuttling by nucleoporins Nup153 and Nup214 and CRM1- dependent nuclear export control the subcellular distribution of latent Stat1. J Cell Biol 165, 823-833.
36. Zhang, X., Blenis, J., Li, H.C., Schindler, C., Chen-Kiang, S. (1995) Requirement of serine phosphorylation for formation of STAT-promoter complexes. Science 267, 1990-1994.
37. Jr. (1998) Ser727-dependent recruitment of MCM5 by Stat1α in IFN-γ-induced tran- scriptional activation. EMBO J 17, 6963-6971.
38. DNA binding of in vitro activated Stat1 alpha, Stat1 beta and truncated Stat1: interaction between NH2-terminal domains stabilizes binding of two dimers to tandem DNA sites. EMBO J 15, 5616-5626.
39. Ramana C.V., Gil, M.P., Schreiber, R.D., Stark, G.R. (2002) Stat1-dependent and - independent pathways in IFN-gamma-dependent signaling. Trends Immunol 23, 96- 101.
40. Zhao, W., Cha, E.N., Lee, C., Park, C.Y., Schindler, C. (2007) Stat2-dependent regu- lation of MHC class II expression. J Immunol 179, 463-471.
41. Takeda, K., Kaisho, T., Yoshida, N., Takeda, J., Kishimoto, T., Akira, S. (1998) Stat3 activation is responsible for IL-6-dependent T cell proliferation through preventing apoptosis: generation and characterization of T cell-specific Stat3-deficient mice. J Immunol 161, 4652-4660.
42. Song, J.I., Grandis, J.R. (2000) STAT signaling in head and neck cancer. Oncogene 19, 2489-2495.
43. Williams, J.G. (2000) STAT signalling in cell proliferation and development. Curr Opin Gen Dev 10, 503-507.
44. Mao, X., Ren, Z., Parker, G.N., Sondermann, H., Pastorello, M.A., Wang, W., McMur- ray, J.S., Demeler, B., Darnell, J.E. Jr., Chen, X. (2005) Structural bases of unphos- phorylated STAT1 association and receptor binding. Mol Cell 17, 761-771.
45. Soler-Lopez, M., Petosa, C., Fukuzawa, M., Ravelli, R., Williams, J.G., Müller, C.W. (2004) Structure of an activated Dictyostelium STAT in its DNA-unbound form. Mol Cell 13, 791-804.
46. Vinkemeier, U., Moarefi, I., Darnell, J.E.Jr., Kuriyan, J. (1998) Structure of the amino- terminal protein interaction domain of STAT-4. Science 279, 1048-1052.
47. Sun, W., Xu, W., Snyder, M., He, W., Ho, H., Ivashkiv, L.B., Zhang, J.J. (2005) The conserved Leu-724 residue is required for both serine phosphorylation and co- activator recruitment for Stat1-mediated transcription activation in response to interfe- ron-gamma. J Biol Chem 280, 41844-41851.
48. Thomson, A. (1998) The cytokine handbook 3rd edn Academic Press, San Diego.
49. Schindler, C. and Darnell, J.E., Jr. (1995). Transcriptional responses to polypeptide ligands: the JAK-STAT pathway. Annu Rev Biochem 64, 621-651.
50. Sadowski, H.B., Shuai, K,. Darnell, J.E. Jr., Gilman, M.Z. (1993) A common nuclear signal transduction pathway activated by growth factor and cytokine receptors. Science 261, 1739-1744.
51. Melén K., Kinnunen, L., Julkunen, I. (2001) Arginine/Lysine-rich structural element is involved in Interferon-induced nuclear import of STATs. J Biol Chem 276, 16447- 16455.
52. Shen, Y., Darnell, J.E. Jr. (2001) Antiviral response in cells containing Stat1 with he- terologous transactivation domains. J Virol 75, 2627-3263.
53. McBride, K. M., Banninger, G., McDonald, C., Reich, N. C. (2002) Regulated nuclear import of the STAT1 transcription factor by direct binding of importin-α. EMBO J 21, 1754-1763.
54. Mascareno, E., Dhar, M., Siddiqui, M.A. (1998) Signal transduction and activator of transcription (STAT) protein-dependent activation of angiotensinogen promoter: a cellular signal for hypertrophy in cardiac muscle. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 5590- 5594.
55. Stark, G.R., Kerr, I.M., Williams, B.R., Silverman, R.H., Schreiber, R.D. (1998) How cells respond to interferons. Annu Rev Biochem 67, 227-264.
56. Vinkemeier, U. (2004) Getting the message across, STAT! Design principles of a mo- lecular signaling circuit. J Cell Biol 167, 197-201.
57. Schmierer, B., Tournier, A.L., Bates, P.A., Hill, C.S. (2008) Mathematical modeling identifies Smad nucleocytoplasmic shuttling as a dynamic signal-interpreting system.
58. Weber, S., Maass, F., Schuemann, M,. Krause, E., Suske, G., Bauer, U.M. (2009) PRMT1-mediated arginine methylation of PIAS1 regulates STAT1 signaling. Genes Dev 23, 118-132.
59. Zhang, J.J., Vinkemeier, U., Gu, W., Chakravarti, D., Horvath, C.M., Darnell, J.E. Jr. (1996) Two contact regions between Stat1 and CBP/p300 in interferon γ signaling.
60. Wojciak, J.M., Martinez-Yamout, M.A., Dyson, H.J., Wright, P.E. (2009) Structural basis for recruitment of CBP/p300 coactivators by STAT1 and STAT2 transactivation domains. EMBO J 28, 948-58.
61. Seidel, H.M., Milocco, L.H., Lamb, P., Darnell, J.E. Jr., Stein, R.B., Rosen, J. (1995) Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal trans- 111
62. Zhong, Z., Wen, Z., Darnell, J.E. Jr. (1994) Stat3 and Stat4: members of the family of signal transducers and activators of transcription. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 4806- 4810.
63. Xuan, Y.T., Guo, Y., Han, H., Zhu, Y., Bolli, R. (2001) An essential role of the JAK- STAT pathway in ischemic preconditioning. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 9050-9055.
64. Wen, Z., Zhong, Z., Darnell, J.E. Jr. (1995) Maximal activation of transcription by Stat1 and Stat3 requires both tyrosine and serine phosphorylation. Cell, 82, 241-250.
65. Wormald, S., Hilton, D.J., Smyth, G.K., Speed, T.P. (2006) Proximal genomic locali- zation of STAT1 binding and regulated transcriptional activity. BMC Genomics 7, 1- 13.

Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten