Funktionelle Analyse von Rho-spezifischen Guaninnukleotidaustauschfaktoren in Ustilago maydis

Kleine GTPasen der Rho-Familie fungieren als molekulare Schalter in einer Vielzahl von zellulären Prozessen, unter anderem bei der Organisation des Aktinzytoskeletts, der Zellpolarität und dem Vesikeltransport. In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere Aspekte der klein...

Full description

Main Author: Schink, Kay Oliver
Format: Dissertation
Language: German
Published: Philipps-Universität Marburg 2010-03-11
Fachbereich Biologie
Edition: http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2010/0099
Subjects:
Online Access: Get full text
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Summary: Kleine GTPasen der Rho-Familie fungieren als molekulare Schalter in einer Vielzahl von zellulären Prozessen, unter anderem bei der Organisation des Aktinzytoskeletts, der Zellpolarität und dem Vesikeltransport. In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere Aspekte der kleinen GTPasen Cdc42 und Rac1 in dem phytophathogenen Pilz Ustilago maydis untersucht. Zum einen wurde untersucht, wie in komplexen GTPase-Signalkaskaden eine spezifische Signalweiterleitung gewährleistet werden kann. So gibt es deutlich mehr Aktivatoren und Effektoren, als das es Rho-GTPasen gibt. So kann eine GTPase oftmals von mehr als einem Aktivator stimuliert werden und ihrerseits mehr als einen Effektor aktivieren. Gleichzeitig ist diese Interaktion nicht immer spezifisch; so können viele Effektoren mit mehr als einer GTPase interagieren. Es stellt sich also die Frage, wie sichergestellt wird, dass die richtige Signalantwort auf einen spezifischen Stimulus erfolgt. Die GTPasen Cdc42 und Rac1 zeigen ein hohes Maß an Sequenzidentität, aber eine Deletion dieser Proteine in U. maydis führt zu vollkommen unterschiedlichen Phänotypen. Daher agieren Cdc42 und Rac1 in unterschiedlichen Signalkaskaden. Aus anderen Organismen war bekannt, dass die Aminosäure an Position 56 eine wichtige Rolle für die spezifische Erkennung von Cdc42 und Rac1 durch Guaninnukleotidaustauschfaktoren spielt. Daher wurde untersucht, welche Rolle die Aktivierung von Rho-GTPasen durch Guaninnukleotidaustauschfaktoren bei der Spezifitätsdetermination spielt. Mit Hilfe eines in vitro-Systems konnte gezeigt werden, dass der GEF Don1 hoch spezifisch den Nukleotidaustausch an der Rho-GTPase Cdc42 katalysiert, während er gegenüber der nah verwandten GTPase Rac1 inert ist. Gleichzeitig reicht ein Aminosäureaustausch an Position 56 von Cdc42 und Rac1 aus, um eine Aktivierung von Rac1W56F durch Don1 zu erlauben. Die Aminosäure an Position 56 scheint gleichzeitig auch der kritische Faktor für die Erkennung von Cdc42 durch Don1 zu sein. Für den GEF Cdc24 konnte gezeigt werden, dass dieser präferentiell Rac1 aktiviert. Auch hierbei ist die Aminosäure an Position 56 ein wichtiger Faktor für die Erkennung der GTPase durch Cdc24. Cdc42 mit einem Aminosäureaustausch an dieser Position, Cdc42F56W, wird von Cdc24 deutlich effektiver aktiviert als Wildtyp-Cdc42. Der korrespondierende Austausch, Rac1W56F, dagegen führt zu einer deutlich schlechteren Aktivierung durch Cdc24. Da die untersuchten Austausche gleichzeitig einen Wechsel der in vivo-Funktion der GTPasen mit sich brachten, stellte sich die Frage, ob alleine die Aktivierung durch einen spezifischen GEF zu einer bestimmten Signalantwort führt oder ob die eingebrachten Austausche auch einen Wechsel der Effektorspezifität und darüber die Aktivierung einer anderen Signalkaskade auslösen. Während die Aktivierung einer beliebigen GTPase durch den GEF Cdc24 ausreichend für eine Cdc24-spezifische Signalantwort ist, ist dies bei der Don1-vermittelten Signalkaskade nicht der Fall. Hier führt ein Austausch der Aminosäure 56 nicht nur zu einem Wechsel der GEF- sondern auch der Effektorspezifität. Als weiterer Punkt dieser Arbeit wurde die Rolle des GEFs Don1 während der Zytokinese untersucht. Während der Zellteilung bildet U. maydis nacheinander zwei Septen aus, die durch eine Fragmentierungszone voneinander getrennt werden. Don1 reguliert zusammen mit Cdc42 die Bildung des sekundären Septums. Don1 gehört zur Familie der Fgd1-verwandten GEFs, die sich durch eine C-terminale lipidbindende FYVE-Domäne auszeichnen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die FYVE-Domäne von Don1 an das Lipid PtdIns(3)P bindet und kritisch für die Funktion dieses GEFs in vivo ist. Die FYVE-Domäne rekrutiert Don1 an endosomale Vesikel, die über das Kinesin-Motorprotein Kin3 in die Zellteilungszone transportiert werden, wo es zu einer asymmetrische Akkumulation der Endosomen auf der Tochterseite des primären Septums kommt. Endosomal lokalisiertes Don1 vermittelt hier die Reorganisation des Aktinzytoskeletts während der Bildung des sekundären Septums. Als finaler Aspekt wurde die Rolle des Exocyst-Komplex während der Zellteilung und dem polaren Wachstum von U. maydis untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das Exocyst-landmark-Protein Sec3 mit Cdc42 und Rac1 interagiert. Eine Deletion dieses Proteins führt zu Polaritäts- und Zytokinesedefekten. Da der Exocyst-Komplex die Fusion von sekretorischen Vesikeln mit der Plasmamembran katalysiert, wurde die Dynamik dieser Vesikel während des knospenden und filamentösen Wachstums untersucht. In U. maydis werden sekretorische Vesikel über lange Strecken entlang von Mikrotubuli transportiert. Dieser Transport erfolgt bidirektional und wird über Kinesin- und Dynein-Motorproteine vermittelt