Künstlich gespaltene Inteine für die Protein-Semisynthese - Charakterisierung des Ssp DnaB Inteins und Modifikation des Ionenkanals OmpF mit Hilfe des Psp-GBD Pol Inteins

Gespaltene Inteine sind leistungsfähige Werkzeuge zur Knüpfung nativer Peptidbindungen zwischen Polypeptidsequenzen. Die von ihnen vermittelte Protein trans-Splei߬reaktion beginnt zunächst mit der Assoziation der Fragmente des gespaltenen Inteins, die Teile von zwei separaten Fusionsproteinen sind....

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Brenzel, Steffen
Beteiligte: Mootz, Henning (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2009
Chemie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Gespaltene Inteine sind leistungsfähige Werkzeuge zur Knüpfung nativer Peptidbindungen zwischen Polypeptidsequenzen. Die von ihnen vermittelte Protein trans-Splei߬reaktion beginnt zunächst mit der Assoziation der Fragmente des gespaltenen Inteins, die Teile von zwei separaten Fusionsproteinen sind. Der gebildete spleißkompetente Inteinkomplex schnei¬det sich anschließend aus dem Vorläufer¬protein heraus und verbindet dabei die fusionierten Polypeptidsequenzen (N- und C Extein) mit¬ein¬ander. Die Spezifität der Inteinassoziation verleiht dieser Ligations¬reaktion einen höchst chemo¬selektiven Charakter. Neben einigen natürlich vorkommenden Vertretern gewinnt die wachsende Zahl der auf künstliche Weise gespaltenen Inteine immer mehr an Bedeutung. Zur Erweiterung der Anwendungsbreite der Protein trans-Spleißreaktion wurde das Ssp DnaB Intein, dessen N und C terminalen Spleißbereiche nach Position 104 gespalten und von der integrierten Endo¬nuclease¬domäne befreit worden waren, in gereinigter Form und unter nativen Reaktions¬bedingungen charakterisiert. Die Abhängigkeit der Spleißaktivität von einer forcierten Assoziation mit Hilfe der durch Rapa¬mycin induzierten Hetero¬dimeri¬sierung der fusionierten FKBP- und FRB-Domänen stand im Fokus der Unter¬suchung¬en. Dabei zeigte sich, dass die Intein¬frag¬mente selbst bereits eine ausgeprägte Affinität besaßen, die eine spontan ein¬setzende Protein trans-Spleißreaktion auch ohne induzierte Dimerisierung ermöglichte. Eine kinetische Analyse belegte zudem, dass die FKBP- und FRB-Assoziation weder auf die Reaktions¬geschwindigkeit noch auf die Ausbeute der Protein trans-Spleißreaktion einen positiven Effekt ausübte. Damit stellte das Ssp DnaB Intein das erste artifiziell gespaltene Intein mit spontaner Spleißaktivität dar, das in vitro keine denaturierende Präparation und anschließende gemeinsame Renaturierung der Inteinfragmente benötigte. Auf diese Weise wurden Anwendungen unter vollständig nativen Bedingungen zur Bewahrung der Aktivität nicht rückfaltbarer Proteine zugänglich. Ein Vergleich mit der Protein trans-Spleißreaktion des Sce VMA Inteins, für die eine induzierte Dimerisierung essentiell war, offenbarte ein ähnliches kinetisches Potential. Allerdings wurde für diese Reaktion ein biphasischer Verlauf beobachtet, der auf eine komplexere Kopplung der einzelnen Reaktions¬schritte hinwies. Eine weitergehende Anwendung der Protein trans-Spleißreaktion konnte durch die Protein-Semi¬synthese des Porins OmpF, das in die äußere Membran von E. coli integriert ist, durchgeführt werden. Der 340 Aminosäuren umfassende Ionenkanal wurde zunächst mit Hilfe des künstlich gespaltenen Psp-GBD Pol Inteins aus zwei rekombinant hergestellten und in 6 M Harnstoff solubilisierten Fragmenten wieder¬her¬ge¬stellt. Durch Rückfaltung konnte der trimere Kanal mit nativer Amino¬säure¬sequenz rekonstituiert werden. Elektrophysiologische Untersuchungen in einer planaren Lipiddoppelschicht (Black Lipid Membrane) belegten, dass auf diese Weise OmpF-Kanäle mit natürlicher Aktivität erhalten werden konnten. Darauf aufbauend wurde eine Strategie zur Herstellung eines semisynthetischen Porins entwickelt, die eine Kombination aus Cystein-Konjugation, Protein trans-Spleißen und Rückfaltung enthielt. Nach dem Einführen von Cysteinresten in die N- und C-terminalen OmpF-Fragmente sowie der Konstruktion einer Cystein-freien Mutante des Psp-GBD Pol Inteins konnte ein Benzo-18-Krone-6-Baustein durch Cystein-Konjugation (K16C) mit dem N-terminalen OmpF-Frag¬ment verknüpft werden. Durch Protein trans-Spleißen wurde die Sequenz des OmpF-Derivats zusammen¬gefügt und nach Rückfaltung der semisynthetische Ionenkanal mit trimerer Struktur erhalten. Der im Lumen der OmpF-Pore präsentierte Kronenether führte zu einem verrin¬gerten Leitwert des Ionenkanals. Diese Reaktionssequenz ermöglicht die chemo- und regio¬se¬lek¬tive Cystein-Konjugation innerhalb eines Fragments unabhängig von weiteren Cystein¬resten in der komplementären Sequenz. Dies kann in Verbindung mit der Click-Reaktion als Ausgangspunkt für vielfältige weiterführende Protein Engineering An¬wen¬dungen genutzt werden. Zusammen¬fassend konnten in dieser Arbeit neue Ansätze etabliert werden, die das Potential von gespaltenen Inteinen für die selektive chemische Modifikation von Proteinen demonst¬rieren und erweitern.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2009.0719