Rosmarinsäure-Biosynthese in Suspensionskulturen von Melissa officinalis L.

Die an der Rosmarinsäure-Biosynthese beteiligten Enzyme konnten bereits in Zellkulturen von Coleus blumei und verschiedenen Lamiaceen und Boraginaceen identifiziert und charakterisiert werden. Dennoch ist bislang wenig über die Regulationsmechanismen des Biosynthesewegs auf genomischer Ebene bekannt...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Weitzel, Corinna
Beteiligte: Petersen, Maike (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2009
Pharmazeutische Biologie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Die an der Rosmarinsäure-Biosynthese beteiligten Enzyme konnten bereits in Zellkulturen von Coleus blumei und verschiedenen Lamiaceen und Boraginaceen identifiziert und charakterisiert werden. Dennoch ist bislang wenig über die Regulationsmechanismen des Biosynthesewegs auf genomischer Ebene bekannt. Diese Arbeit sollte durch genaue Untersuchung der Rosmarinsäure-Biosynthese in einer diploiden Melissa officinalis-Suspensionskultur die Grundlage für die Aufklärung regulatorischer Mechanismen legen. Zu diesem Zweck waren eine genaue Charakterisierung der Zellkultur und die Charakterisierung der an der Biosynthese beteiligten Enzyme sowohl im Proteinrohextrakt als auch nach Klonierung und heterologer Expression in E. coli erforderlich. Rosmarinsäure, Hauptbestandteil der sogenannten Labiatengerbstoffe, ist ein Ester aus Kaffeesäure und 3,4-Dihydroxyphenylmilchsäure, der im Pflanzenreich weit verbreitet anzutreffen ist. Für die Pflanzen erfüllt er vermutlich die Rolle eines konstitutiv gebilde-ten Abwehrstoffes zum Schutz vor Fraßfeinden. Die Biosynthese geht von den beiden Aminosäuren L-Phenylalanin und L-Tyrosin aus. Diese werden nach enzymatischer Umwandlung zu 4-Cumaroyl-CoA und 4-Hydroxyphenyllactat durch die Rosmarinsäure Synthase, einer Acyltransferase aus der Familie der BAHD-Enzyme, miteinander vere-stert und das Reaktionsprodukt durch anschließende 3- und 3’-Hydroxylierung zu Rosmarinsäure umgesetzt. Suspensionskulturen der Melisse sind in der Lage in kurzen Kulturperioden in Abhängigkeit vom Saccharosegehalt des Mediums bezogen auf das Zelltrockengewicht bis zu 7 % Rosmarinsäure zu akkumulieren (in Medium mit 4 % Saccharose). Durch Zugabe von Methyljasmonat ist eine weitere Steigerung möglich. Die Umwandlung des L-Phenylalanins zum Hydroxyzimtsäure-CoA-Ester erfolgt durch die Enzyme des allgemeinen Phenylpropanstoffwechsels: Phenylalanin Ammoniak-Lyase (PAL), Zimtsäure 4-Hydroxylase (C4H) und Hydroxyzimtsäure:CoA-Ligase (4CL). Zusätzlich zur detaillierten Charakterisierung der nativen Enzyme gelangen Klonierung und Charakterisierung je einer PAL- und 4CL-Isoform. Für beide Enzyme konnte durch Southern Blotting die Existenz zweier Genkopien nachgewiesen werden. mRNA-Expressionsprofile, die sowohl für die PAL als auch für die 4CL über einen Kultivierungszeitraum von 10 Tagen in Medium mit 2 % Saccharose erstellt wurden, weisen auf eine mögliche Beteiligung der klonierten Isoformen an der Rosmarinsäure-Biosynthese hin. Mithilfe der zur Klonierung verwendeten Volllängenprimer war es außerdem möglich, die genomischen Sequenzen beider Enzyme aufzuklären. Die genomische Sequenz der PAL weist ein charakteristisches Intron auf, welches in den PAL-Sequenzen der An-giospermen in einer konservierten Position zu finden ist. Die genomische Sequenz der klonierten 4CL ist hingegen Intron-frei. Katalysiert durch die Tyrosin Aminotransferase (TAT) wird L-Tyrosin zunächst in 4-Hydroxyphenylpyruvat umgewandelt. Die im Proteinrohextrakt aus Melissen-Suspensionskulturen ermittelten kinetischen Parameter korrelieren gut mit den Werten die bereits zuvor für das Enzym in Pflanzen (Coleus blumei, Anchusa officinalis), Säugetieren (Ratte) oder Protozoen (Trypanosoma cruzi) bestimmt wurden. Mithilfe der RACE-PCR konnte eine cDNA-Teilsequenz aufgeklärt werden, die große Übereinstimmung mit anderen TAT-Sequenzen aufweist. Durch ein weiteres Enzym, die sogenannte Hydroxyphenylpyruvat Reduktase (HPPR) wird das 4-Hydroxyphenylpyruvat zum Lactat reduziert. Die in Coleus blumei-Proteinrohextrakten ermittelten Substratpräferenzen dieses Enzyms konnten für das native Enzym aus Melissa officinalis bestätigt werden. Auch im Proteinrohextrakt aus Melissen-Suspensionskulturen wurde für 4-Hydroxyphenylpyruvat ein niedrigerer apparenter Km-Wert als für 3,4-Dihydroxyphenyllactat (5 µmol/l respektive 28 µmol/l) und für NADPH ein niedrigerer Wert als für NADH ermittelt (58 µmol/l respektive 90 µmol/l). Noch ungeklärt ist die Frage, ob es sich bei der HPPR um ein spezifisches Enzym des Rosmarinsäure-Biosynthesewegs handelt oder ob die Reaktion durch ein Enzym der Photorespiration, die cytosolische Hydroxyphenylpyruvat Reduktase (HPR), katalysiert wird. Die Rosmarinsäure Synthase (RAS) verestert die mit Coenzym A aktivierten (Hydroxy-) Zimtsäuren mit den Produkten der HPPR. Da die bislang bekannten RAS, die aus zwei Coleus-Arten, Plectranthus fruticosus und Melissa officinalis kloniert werden konnten, lediglich 4-Hydroxyphenyllactat und 3,4-Dihydroxyphenyllactat jedoch weder Chinasäure noch Shikimisäure als Akzeptorsubstrate akzeptieren, gilt dieses Enzym als das möglicherweise einzige spezifische Enzym des Biosynthesewegs. Im Genom der Melisse konnte durch Southern Blotting nur eine RAS-Genkopie nachgewiesen werden.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2009.0715