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Zusammenfassung:
Der für viele vitale Prozesse essentielle Calciumgradient zwischen dem Intrazellulärraum und dem Extrazellulärraum ([Ca2+]IZ = 10-7 M, [Ca2+]EZ = 10-3 M) wird durch eine Vielzahl von Transportsystemen aufrechterhalten. Ein zentrales dieser Enzyme ist die Ca2+-ATPase der Plasmamembran (PMCA). Strukturell ist die PMCA ein etwa 130 kDa großes Membranprotein mit 10 Transmembransegmenten. Von der PMCA existieren bei den Säugetieren 4 unterschiedliche Isoformen, durch alternatives Spleißen können aus diesen 4 Isoformen mehr als 30 Spleißvarianten entstehen. Über die funktionellen Unterschiede dieser Spleißvarianten ist bis heute nur wenig bekannt. Während die PMCA-Isoformen 1 und 4 ubiquitär vorkommen, sind die Isoformen 2 und 3 bisher nur im Gehirn und wenigen anderen Geweben nachgewiesen worden. Durch PMCA Knockout-Mäuse konnten in den letzten Jahren interessante Erkenntnisse über die Funktionalität der PMCA gewonnen werden. So führt ein Verlust der PMCA1 zur embryonalen Letalität. Mäuse mit einem homozygoten Verlust der PMCA2 sind taub und haben eine Gleichgewichtsstörung. Obwohl PMCA4 knockout Mäuse äusserlich normal erscheinen, sind die Mäuse infertil. Ursächlich ist eine Hypomotilität der Spermien, während ihre Spermatogenese und ihr Fortpflanzungsverhalten unbeeinträchtigt erscheinen. In dieser Arbeit wurden die Expression sowie die Lokalisation der PMCA-Isoformen in den Geschlechtsorganen des Bullen untersucht. Es fand sich, dass die Isoform 1 sowohl im bovinen Hoden, als auch in der Bläschendrüse und den drei Nebenhodenabschnitten Caput, Corpus und Cauda epididymidis exprimiert wird. Eine Expression der PMCA2 fand sich lediglich im bovinen Hoden, die Expression der PMCA3 war auf den Nebenhodenkopf beschränkt. Die PMCA4 wird in allen untersuchten Organen exprimiert. Allerdings findet ein Spleißvarianten-Wechsel zwischen dem Nebenhodenkörper und dem Nebenhodenschwanz von der PMCA4b zur Spleißvariante 4a statt, der in dieser Arbeit genauer untersucht wurde. Die Sequenz der bovinen PMCA4 war nicht bekannt. Die beiden PMCA4 Spleißvarianten wurden deshalb kloniert und sequenziert, wodurch es möglich war, einen bullenspezifischen Antikörper gegen PMCA4a herzustellen. Der selbst hergestellte Antikörper gegen die PMCA4a führte in der Immunhistochemie lediglich im Bereich des Nebenhodenschwanzes zu einer positiven Reaktion. Er färbte dort den apikalen Pol der Epithelzellen und bläschenartige Abschnürungen dieser Zellen – die sogenannten Epididymosomen an. Im Western Blot konnten mithilfe des PMCA4a-Antikörpers Hinweise dafür gefunden werden, dass die PMCA4a während der Nebenhodenschwanzpassage auf die bovinen Spermien übertragen wird, da nur Membranen aus Spermien, die aus dem Nebenhodenschwanz isoliert wurden, die PMCA4a in ihrer Membran besitzen. In Membranen der Nebenhodenkopfspermien und im bovinen Testis konnte die PMCA4a hingegen nicht detektiert werden. Der Mechanismus der Sekretabgabe in Form von apikalen Vesikeln wird seit längerer Zeit postuliert und von verschiedenen Gruppen als apokriner Sekretionsmechanismus bezeichnet. In einem zweiten Abschnitt dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, inwieweit eine Interaktion zwischen der PMCA und dem bovinen Bläschendrüsenprotein PDC-109 stattfindet, das an das Mittelstück boviner Spermien bindet. PDC-109 ist das quantitativ wichtigste Protein der Bläschendrüse des Bullen. Über zwei Fibronektin-Typ 2– ähnliche Domänen kann das PDC-109 mit Phosphatidylcholin, Heparin u.a. Molekülen interagieren. In vitro versetzt das PDC-109 die bovinen Spermien in einen Zustand der Hypermotilität. Durch einen Assay, der überexprimierte humane PMCA verwendet, konnte gezeigt werden, dass die PMCA-Isoformen 2 und 4 durch das PDC-109 gehemmt werden. Die Hemmung ist also nicht Isoform-spezifisch. Da auch die Na+/K+-ATPase durch PDC-109 gehemmt wird, dürfte es sich bei der Hemmung eher um einen generellen Membran-desintegrierenden Effekt des PDC-109 handeln. Zugleich wurden im Rahmen dieser Arbeit Mutanten des PDC-109 hergestellt, deren Effekt auf die PMCA im Rahmen zukünftiger Studien zu untersuchen sein wird. Diese Arbeit liefert somit starke Hinweise dafür, dass die PMCA4a durch apokrine Sekretion im Bereich des Nebenhodenschwanzes auf bovine Spermien übertragen wird. Zum anderen wird ein hemmender Effekt des Bläschendrüsenproteins PDC-109 auf die PMCA dargestellt. Damit werden zwei wesentliche neue Funktionsprinzipien des Nebenhodens dokumentiert.

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