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Zusammenfassung:
Die sieben Gene des Zaire Ebolavirus (ZEBOV) werden im RNA-Genom durch hoch konservierte Transkriptionsstartsignale und –stoppsignale flankiert. An den Gengrenzen treffen das Stoppsignal des vorangehenden und das Startsignal des nachfolgenden Gens in unterschiedlicher Weise aufeinander. Entweder überlappen die beiden Signale, oder sie sind über nicht transkribierte intergenische Regionen (IRs) variabler Länge und Sequenz getrennt. Nicht segmentierte negativ-strängige RNA-Viren besitzen nur einen am 3’-Ende des Genoms gelegenen Transkriptionspromotor. Einzig die cis-aktiven Signale an den Gengrenzen steuern somit über Interaktion mit dem viralen Polymerasekomplex alle bei der Transkription ablaufenden Prozesse, wie die Termination und Reinitiation der Transkription sowie das Capping und Polyadenylieren der mRNA. Eine Möglichkeit, die Syntheserate viraler mRNA und damit die Produktion viraler Proteine zu regulieren, ist, die Bildung polycistronischer (Readthrough-) mRNAs durch das Überlesen von Transkriptionsstoppsignalen zu induzieren. Diesen wird eine Rolle bei der spezifischen Reduktion einzelner Genprodukte zugeschrieben, da sie schlecht translatiert werden. Solche Transkripte waren bislang für ZEBOV nicht beschrieben, konnten im Rahmen dieser Arbeit jedoch in mit Virus infizierten Zellen nachgewiesen werden. Dabei war interessant, dass sie unabhängig von der Struktur der Gengrenzen, also sowohl bei solchen mit überlappenden als auch mit durch IR getrennten Transkriptionssignalen, gebildet wurden. Um nun der Frage weiter nachzugehen, inwieweit die Transkriptionsaktivität über die unterschiedlich strukturierten Gengrenzen reguliert wird, wurden bicistronische Minigenome eingesetzt. In diesen sind zwei Reportergene durch ZEBOV-spezifische Gengrenzen voneinander separiert. Zunächst wurde die Transkriptionsaktivität von Minigenomen mit unterschiedlichen Wildtyp-Gengrenzen (IR 5nt, IR 144nt und eine Überlappung) untersucht. Dies erfolgte sowohl in mit ZEBOV infizierten Zellen als auch in einem rekonstruierten ZEBOV-spezifischen Replikations- und Transkriptionssystem. Interessanterweise deuteten die Ergebnisse übereinstimmend auf eine durch die IRs beeinflusste Regulation der Transkription hin, da die Reinitiationsfrequenz bei einer Gengrenze mit einer langen IR am niedrigsten war. Viele Negativstrang-RNA-Viren nutzen die intergenischen Regionen, um die Erkennung der angrenzenden Transkriptionssignale zu regulieren. Da die Transkriptionssignale bei ZEBOV sehr hoch konserviert sind, die IRs jedoch variabel, legte das einen Einfluss auf die Erkennung der angrenzenden Signale nahe. Erstaunlicherweise führte jedoch die Deletion, Substitution oder Verlängerung der beiden untersuchten IRs nicht zu einem Verlust der Genexpression. Daraus folgt, dass die IRs in ZEBOV für die Expression angrenzender Gene nicht essentiell sind. Die Analyse der transkribierten mRNA sowie die Quantifizierung der gebildeten Proteinmenge bestätigten allerdings, dass die IRs die Reinitiationsfrequenz am nachfolgenden Gen regulieren. Die Sequenz der IR konnte dabei als maßgeblicher Faktor ausgeschlossen werden. Vielmehr spielte die IR-Länge eine bedeutende Rolle. Entgegen den Erwartungen ließ sich hierbei keine direkte Korrelation zwischen IR-Länge und Reinitiationsfrequenz feststellen, wie sie für andere Viren beschrieben wird. Vielmehr konnte für beide untersuchten Gengrenzen bei IRs von 10-30 Nukleotiden Länge eine starke Reduktion des Neustartens beobachtet werden, während eine Inhibition der Reinitiation bei IR-Längen von 5 oder >40 Nukleotiden nicht auftrat. Die Hemmung der viralen Polymerase über IRs bestimmter Länge konnte auch in der Virusinfektion bestätigt werden. Eine derartige Regulation ist bislang bei anderen Viren nicht bekannt. Dies könnte auf eine für ZEBOV einmalige Erkennung der Startsignale hindeuten, die von der spezifischen Verpackungseinheit des Genoms abhängig ist. An zwei Gengrenzen im ZEBOV-Genom überlappen die Transkriptionssignale aufeinander folgender Gene, wobei sie sich ein hoch konserviertes Pentamer teilen. Diese Gengrenzstruktur ist für Filoviren einzigartig. Aufgrund der Überlappung trifft die virale Polymerase bei der Transkription zuerst auf das Startsignal des stromabwärts liegenden Gens, bevor sie zu dem Stoppsignal des stromaufwärts liegenden Gens gelangt. Eine Mutation des Transkriptionsstartsignals beeinflusste die Erkennung des überlappenden Transkriptionsstoppsignals nicht. Hingegen war ein funktionelles Stoppsignal essentiell für die Reinitiation am überlappenden Startsignal. Stoppen und Neustarten sind somit in ZEBOV funktionell miteinander verknüpft, was den generellen Ablauf der Transkription nach einem für alle nicht segmentierten negativ-strängigen RNA Viren beschriebenen Modell bestätigen konnte. Eine Insertionsmutagenese an dieser Gengrenze verschob das überlappende Startsignal stromaufwärts. Die Untersuchung der gebildeten mRNA zeigte, dass die filovirale Polymerase in der Lage war, überlappende Transkriptionssignale effizient zu erkennen, die in umgedrehter Reihenfolge durch bis zu 21 Nukleotide getrennt vorlagen. In dieser Arbeit konnte bestätigt werden, dass auch die Filoviren bei Stoppen und Neustarten der Transkription einem generell für alle negativ-strängigen nicht segmentierten RNA-Viren vorgeschlagenen Modell zu folgen scheinen. Dennoch weisen die Ergebnisse auf für Filoviren einzigartige, komplexe Regulationsmechanismen hin, die eine spezifische Kontrolle der viralen Polymerase über die an den Gengrenzen gelegenen cis-aktiven Signale nahe legen.

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