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Titel:Strukturelle Aufklärung und funktionelle Charakterisierung der DNA-Reparaturprozesse in DNA-Photolyasen und Cryptochrom 3
Autor:Klar, Tobias
Weitere Beteiligte: Essen, Lars-Oliver (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2007
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2008/0476
DOI: https://doi.org/10.17192/z2008.0476
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2008-04763
DDC:540 Chemie
Titel (trans.):Structural and functional characterization of the DNA repair processes in DNA photolyases and cryptochrome 3
Publikationsdatum:2008-09-09
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
CPD, Deoxyribopyrimidin-Photolyase, Thermus thermophilus, Photolyase, Proteine, CPD, DNS-Reparatur, Strukturanalyse, Chromophor, Flavin, Kristallstruktur, Cryptochrom, DNA-Schaden, Cryptochrome, Flavine, Anacystis nidulans, DNA lesion, Antennenchromophore

Zusammenfassung:
Die Einwirkung von kurzwelliger UV-Strahlung führt in allen Organismen durch die Bildung von Photoaddukten zu schwerwiegenden Schädigungen der die Erbinformationen tragenden DNA. Die überwiegend auftretenden Photoschäden sind hierbei Cyclobutanpyrimidindimere (CPDs), die durch eine photochemisch induzierte Zyklisierungsreaktion von zwei auf einem DNA-Strang benachbarten Pyrimidinen, meist Thyminen, entstehen. Die für die genetische Integrität eines Organismus notwendige Reparatur wird in vielen Lebewesen mit Hilfe von Photolyasen durch die blaulichtinduzierte Spaltung dieser Dimere bewerkstelligt. Demzufolge besteht ein großes Interesse an der Aufklärung des Reparaturmechanismus, der diesen Enzymen zugrunde liegt. Bis zum Beginn dieser Arbeit lagen drei Proteinkristallstrukturen von Photolyasen vor, die ohne Substrat kristallisiert wurden. Diese Arbeit präsentiert die bei einer Auflösung von 1.8 Å gelöste Cokristallstruktur von A. nidulans Photolyase in einem Komplex mit Duplex-DNA, die einen synthetisch hergestellten CPD-Schaden enthält. Der unter dem Einfluss der verwendeten Synchrotronstrahlung bei 100 K in zwei Thymine gespaltene CPD-Schaden ist vollständig aus der Duplex-DNA heraus- und in das aktive Zentrum der Photolyase hineingedreht. Die Struktur imitiert ein strukturelles Intermediat während der DNA-Reparatur, in dem das Zurückdrehen der Thymine in die Duplex-DNA noch nicht stattgefunden hat. Sowohl die seit langem bestehende und durch Modellrechnungen, biochemische Daten sowie NMR-Spektroskopie gestützte Hypothese des dinucleotid-flipping-Mechanismus, als auch das Knicken der DNA um 50 ° bei DNA-Bindung, konnten mit Hilfe dieser Struktur bestätigt werden. Gleichermaßen konnten die exakte Geometrie des katalytischen Flavincofaktors und der genaue Bindungsmodus des CPD-Schadens mit der Photolyase aufgeklärt werden. Die beobachteten Wechselwirkungen des Substrats mit der Proteinumgebung definieren die Sequenzabfolge 5-NpT◊TpNpNp-3 als allgemeines Erkennungsmotiv für Photolyasen. Aus strukturellen Überlegungen heraus ergeben sich für den Elektronentransport vom FAD auf den CPD-Schaden sowohl ein direkter Weg über die C8-Methylgruppe des FAD als auch ein indirekter Weg, der über die Beteiligung des Adeninrestes verläuft. Die im Verlauf dieser Arbeit erhaltenen strukturellen Erkenntnisse liefern wertvolle Informationen über das detaillierte Verständnis des wichtigsten direkten DNA-Reparaturprozesses. Cryptochrome sind strukturell eng mit den Photolyasen verwandt und bilden mit ihnen eine Superfamilie. Sie gehören zu den wichtigsten Blaulichtrezeptoren und steuern bspw. die circadiane Rhythmik in vielen Lebewesen. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Struktur und der Charakterisierung von Cryptochrom 3 (Cry3) aus A. thaliana. Das Enzym gehört zur Klasse der sogenannten DASH-Cryptochrome, deren Funktion bisher weitgehend ungeklärt ist. Durch die Aufklärung der Kristallstruktur von A. thaliana Cry3 bei einer Auflösung von 1.9 Å konnte MTHF als Antennenchromophor identifiziert werden. Die Cokristallstruktur von A. thaliana Cry3 mit einem Pentanukleotid, das einen CPD-Schaden enthält, konnte ebenfalls erfolgreich röntgenkristallographisch bei einer Auflösung von 2.0 Å gelöst werden. Analog zu der für A. nidulans Photolyase erhaltenen Cokristallstruktur, ist der DNA-Schaden ebenfalls im reparierten Zustand vor dem Zurückdrehen der beiden Thymine aus der Bindungstasche gebunden. Des Weiteren entspricht der beobachtete Bindungsmodus von DNA an A. thaliana Cry3 nahezu dem für die Photolyase festgestellten. Für die Elektronentransportwege ist daher zu vermuten, dass sie weitgehend übereinstimmen. Zur Erweiterung ihres aktiven Spektrums besitzen Photolyasen als Antenntenchromophore 8-HDF, MTHF oder FAD. Die im dritten Teil dieser Arbeit durchgeführten ELISA-Aktivitätsassays an FMN-haltiger T. thermophilus Photolyase zeigen im Vergleich mit der cofaktorfreien R46E-Mutante bei 450 nm eine achtfach höhere Reparaturaktivität und bestätigen damit die Bedeutung des alternativen Antennenchromophors FMN. Durch Rekonstitution der T. thermophilus Photolyase mit natürlich vorkommendem FMN und 8-HDF sowie dem artifiziellen 8-Iodo-8-demethylriboflavin (8-IRF) und anschliessender kristallographischen Bestimmung der Bindungsmodi konnten die Vielseitigkeit der Antennenbindungstasche klar beweisen. Der Einbau unterschiedlicher Antennenchromophore mit verschiedenen spektralen Eigenschaften ermöglicht so künftig ein „Wellenlängentuning“ und die Erweiterung des aktiven Spektrums für die DNA-Reparatur von Photolyasen.


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