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Titel: Molekulare in vivo Fluoreszenzbildgebung zur Darstellung von ErbB/Her2- und CCK2-rezeptorpositiven Tumoren im Tiermodell
Autor: Tischer, Nadine
Weitere Beteiligte: Alfke, Heiko (Prof.)
Erscheinungsjahr: 2008
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2008/0254
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2008-02547
DOI: https://doi.org/10.17192/z2008.0254
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Molecular in vivo fluorescence imaging of erbB2 and cck2 receptor positive tumors

Dokument

Schlagwörter:
Fluorezenz, Molekulare Bildgebung, Trastuzumab, Herceptin, ErbB2 receptor, Bildgebendes Verfahren, Rezeptor, Fluorescence, ErbB2, Molecular imaging, Herceptin

Zusammenfassung:
Die große Herausforderung der molekularen Bildgebung liegt darin, biochemische Vorgänge auf Zellebene sichtbar zu machen. Eine interessante Methode hierfür ist die in vivo Fluoreszenzbildgebung im Nahinfrarotbereich. Aufgrund des günstigen Absorptionsspektrums von Hämoglobin und Wasser im nahinfraroten Bereich kann die Strahlung von Fluoreszenzfarbstoffen, die im nahinfraroten Bereich des Spektrums absorbieren, besonders gut Gewebe durchdringen. In dieser Arbeit wurde mit geeigneten Liganden und dieser Methode versucht, CCK2-, sowie ErbB/Her2-rezeptorpositive Tumore im Tiermodell darzustellen. Als Ligand des CCK2-Rezeptors diente D-Glu1-Minigastrin, ein Peptid, das bereits zur szintigraphischen Bildgebung des CCK2-Rezeptors eingesetzt wird. D-Glu1-Minigastrin konnte erfolgreich an den Fluoreszenzfarbstoff Cy5.5-NHS gebunden werden. In in vitro Bindungsstudien konnte jedoch nicht gezeigt werden, dass dieses Substrat mit ausreichender Affinität und Selektivität an den CCK2-Rezeptor bindet. Vielleicht ist dies erklärbar durch eine unzureichende Stabilität der Substanz in wässrigen Medien, oder aber durch eine Beein¬flussung der Rezeptorbindungsstellen des Peptids durch den lipophilen Fluoreszenzfarbstoff, so dass die Affinität der Substanz zum Rezeptor gestört wird. Auch in in vivo Versuchen kamen die Rezeptoren nicht zur Darstellung, so dass dieser Teil der Arbeit nicht weiter verfolgt wurde. Zur Darstellung des ErbB/Her2-Rezeptors wurden Herceptin®, ein Antikörper der in der Therapie des metastasierten ErbB/Her2-positiven Mammakarzinoms eingesetzt wird, und dessen F(ab’)2- und F(ab’)-Fragmente als Liganden aus¬gewählt. Bei den Fragmenten sollte durch ihr niedrigeres Molekulargewicht eine schnellere Blutclearance und dadurch ein besseres Signalrauschverhältnis erreicht werden. Die Liganden konnten erfolgreich hergestellt, an Cy5.5-NHS gebunden und aufgereinigt werden. In Bindungsstudien konnten IC50-Werte ermittelt werden, die zeigen, dass Herceptin® und seine Fragmente in vitro mit guter Affinität an den ErbB/Her2-Rezeptor binden. Daraufhin wurden konfokale Mikroskopieversuche mit ErbB/Her2-positiven SKOV3-Zellen durchge¬führt. Die Zellen wurden für bis zu 24 h mit jeweils einem von den drei Liganden inkubiert. Im Fall der Antikörperfragmente ließen sich nach 9 h, bei dem kompletten Antikörper nach 24 h deutliche Fluoreszenzsignale im Inneren der Zellen nachweisen, so dass von einer Internalisierung des Rezeptorkomplexes in das Zytoplasma der Zelle ausgegangen werden kann. Nachdem in vitro in der Zellkultur gezeigt werden konnte, dass die CyDye-markierten Antikörper und deren Fragmente mit ausreichender Affinität an die ErbB/Her2-Rezeptoren binden, wurde mittels NIR-fluorescence reflectance imaging die in vivo Bildgebung an Mäusen mit ErbB/Her2-positiven Tumoren erprobt. Die ErbB/Her2-positiven Tumoren ließen sich mit den Rezeptor¬liganden Cy5.5-Herceptin® und Cy5.5-F(ab’) erfolgreich darstellen, im Falle des Cy5.5-F(ab’)2-Fragments hob sich der Tumor nur sehr schlecht vom übrigen Ge¬webe ab. Eine Begründung ist am ehesten in der Pharmakokinetik und dem Verhältnis zwischen Gewebediffusion und Blutclearance der Antikörperfrag¬mente zu finden. Auf Grundlage dieser Ergebnisse sind verschiedene klinische Anwendungen der molekularen Darstellung des ErbB/Her2-Rezeptors vorstellbar. Eine Anwendung in der nichtinvasiven Diagnostik des Her2neu positiven Mamma¬karzinoms ist denkbar. So könnte nichtinvasiv der Rezeptorstatus eines Mammatumors festgestellt werden und beispielsweise die Indikation zu einer neoadjuvanten Therapie mit Herceptin® gestellt werden, sollte sich in Zukunft ein neoadjuvanter Einsatz von Herceptin® als therapeutisch sinnvoll erweisen. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit der Fluoreszenz¬bildgebung mit Herceptin® und Herceptin®-Fragmenten ist die intraoperative oder laparoskopische Darstellung abdomineller Metastasen von ErbB/Her2neu-positiven Ovarial-, Zervix-, Colon-, und Mammakarzinomen. Intraoperative und endo¬skopische Fluoreszenzbildgebungssysteme existieren bereits.

Summary:
The great aim of molecular imaging is to visualize biochemical processes at the cellular level. An interesting method for this purpose is in vivo near-infrared fluorescence imaging. However, the strong UV-VIS-absorption of blood and tissue due to hemoglobin and its derivatives makes it necessary to move to fluorescent dyes which absorb in near-IR and therefore reach much higher fluorescence emission intensities in tissue. Exploiting this methodology, near-IR fluorescent dyes were coupled to peptide ligands for CCK2 and ErbB/Her2 to image tumors expressing these receptors in an animal model. As ligand for the CCK2 receptor, we chose D-Glu1-minigastrin, a peptide which had already been employed for the scintigraphic imaging of this receptor. D-Glu1-minigastrin could be coupled with the activated dye Cy5.5-NHS, but in vitro binding studies showed that the construct does not represent a high-affinity ligand to the CCK2 receptor. A possible rationale for this is that the receptor binding of the peptide is negatively affected by the covalently bound hydrophobic dye. In vivo studies supported the data collected in the binding assays. Herceptin, an antibody used in the therapy of metastasizing Her2-positive breast cancer, was chosen as a suitable ligand for imaging the ErbB/Her2 receptor. In addition, the F(ab’)2 - and F(ab’)-fragments of herceptin were studied as possible ligands. We expected them to show a more favorable signal to noise ration due to their lower molecular weight and therefore faster blood clearance. The ligands could be successfully prepared, coupled to Cy5.5-NHS. The IC50 values obtained from binding assays with herceptin and its antibody fragments indicate a high-affinity interaction with the ErbB/Her2 receptor. Encouraged by these results, we turned to microscopic investigations with ErbB/Her2-positive SKOV3 cells. For this purpose, the cells were incubated for up to 24 h with either herceptin, its F(ab’)2 - or its F(ab)’ fragment. After 9 h in case of the antibody fragments and 24 h in case of herceptin, distinct fluorescence signals could be observed inside the cells, indicating efficient cellular internalization of the receptor-ligand complex. After having shown in vitro as well as in cell culture assays that the Cy5.5-labeled antibodies and their fragments efficiently bind to ErbB/Her2 receptors, we tried in vivo imaging of mice carrying Her2-positive tumors by NIR-fluorescence reflectance techniques. The ErbB2-positive tumors could be successfully imaged with our dye-labeled ligands Cy5.5-herceptin and Cy5.5-F(ab’). In case of the Cy5.5-F(ab’)2 fragment however, only poor contrast between tumor and surrounding tissue could be obtained, possibly due to less favorable pharmacokinetic properties of the F(ab’)2 fragment. Possible clinical applications of these results may arise in the non-invasive diagnostics of ErbB/Her2neu-positive breast tumors. Once the receptor-status of a diagnosed tumor is established using the previously discussed imaging techniques, a rational therapy using herceptin can be envisaged. Further applications of fluorescence imaging with herceptin derivatives are the intraoperative or laparoscopic identification of abdominal metastases of ErbB/Her2neu-positive ovarial, cervical, colon or breast tumors, using existing endoscopic fluorescence imaging apparatus.


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