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Zusammenfassung:
Acridone stellen einen eher ungewöhnlichen Alkaloidtyp dar, da sich ihr Vorkommen bisher mit wenigen Ausnahmen nur auf die Familie der Rutaceae beschränkt. Über die Synthese der Acridonalkaloide und ihre Bedeutung für die Pflanze ist bisher nur wenig bekannt. Eine nachweislich antikanzerogene Wirkung gibt ihnen eine gewisse pharmazeutische Bedeutung (Gröger, 1988) Ruta graveolens L., die Weinraute, ist eine im Mittelmeerraum beheimatete Staude, die bereits in der Antike als Heil- und Gewürzpflanze Verwendung fand. Wegen der in Ruta graveolens enthaltenen Acridone, ist sie eine exzellente Modellpflanze für die Untersuchung von deren Biosynthese, was durch bereits etablierte Ruta-Zellkulturen vereinfacht wird. Die Anthranilat N-Methyltransferase (ANMT) nimmt eine bedeutende Stellung ein. Das Enzym leitet durch eine N-Methylierung Anthranilat aus dem primären in den sekundären Stoffwechsel u.a. in die Biosynthese von Acridonen ein. Bisher war jedoch jeder Versuch einer Isolierung der ANMT aus Ruta graveolens erfolglos (Burga, 2005; Maier et al., 1995). Aus induzierten Ruta graveolens Zellkulturen konnte nun durch klassische Proteinreinigung eine Proteinbande von ca. 40 kDa partiell gereinigt werden. Nach anschließender Mikrosequenzierung wurden die dabei erhaltenen Peptidfragmente zur Erstellung degenerierter Primer verwendet, die erfolgreich für eine Amplifizierung der vollständigen RgANMT-cDNA eingesetzt wurden. Es zeigte sich ein offener Leserahmen von 1095 bp, der für eine Polypeptidsequenz von 365 Aminosäuren kodiert. Das in E. coli rekombinant exprimierte Enzym zeigte sich spezifisch für Anthranilat mit Km-Werten von 7,1 µM für Anthranilat und 3,3 µM für das Co-Substrat SAM. Andere getestete Substrate wurden nicht akzeptiert. Auch Anthraniloyl-CoA unterlag keiner Methylierung, wodurch eindeutig bestätigt wird, dass in Ruta graveolens zunächst eine N-Methylierung von Anthranilat durch die ANMT erfolgt. Erst im darauffolgenden Schritt findet eine Aktivierung durch die korrespondierende CoA Ligase statt. Die weitere biochemische Charakterisierung zeigte eine optimale Enzymaktivität bei pH 7,5 in Natrium-Glycinat-Puffer und die höchste Enzymaktivität bei einer Temperatur von 37 °C. Außerdem wurde für die ANMT eine Hemmung durch zweiwertige Metallionen, vor allem durch Fe2+, Fe3+, Cu2+ und Zn2+ nachgewiesen. Eine Beeinflussung durch Mg2+-Ionen ist nicht gegeben, was die Einordnung der ANMT in die Klasse II pflanzlicher MTn zulässt. Diese Zuordnung wurde zudem durch die Bestimmung des molekularen Gewichts mittels SDS-PAGE mit 40 kDa und durch Gelpermeationschromatographie mit 80 kDa bestätigt. So konnte auch deutlich gezeigt werden, dass es sich beim aktiven Enzym um ein Homodimer handelt. Zur weiteren Charakterisierung fanden Expressionsstudien der ANMT sowohl in der Zellkultur als auch direkt in der Pflanze statt. Für beide Systeme konnte eine konstitutive Expression der ANMT gezeigt werden, was die Bedeutung der Acridone als Phytoanticipine verdeutlicht. Bei der Zellkultur zeigte sich durch Hefeinduktion eine Zunahme sowohl der ANMT-Proteinmenge als auch der Aktivität. In der Pflanze zeigte sich die stärkste Akkumulation von mRNA-Transkripten in Blüten und Wurzeln. Aber auch in Blättern und Stängeln konnten Transkripte nachgewiesen werden. Somit scheint in Ruta graveolens keine Verlagerung der Acridone aus der Wurzeln in die anderen Pflanzenteile notwendig zu sein wie für viele Alkaloide anderer Pflanzenarten beschrieben (Junghanns et al., 1998). Überraschend waren sowohl die hohe Identität der primären ANMT-Sequenz als auch die phylogenetische Einordnung der ANMT in die Gruppe der O-Methyltransferasen, was eine Verwandtschaft der ANMT zu dieser MT-Klasse zeigt. Dies lässt den Schluss zu, dass sich die ANMT höchstwahrscheinlich aus einem Zweig der O-Methyltransferasen bzw. einem gemeinsamen Vorläufer entwickelt hat. Die erfolgreiche Isolierung der ANMT stellt einen bedeutenden Schritt nicht nur für die Aufklärung der Acridonbiosynthese dar. Damit ist ein mächtiges Werkzeug für die Durchführung von Regulationsstudien gegeben, in denen die Auswirkungen auf Pflanzen ohne Acridonbiosynthese nach Transformation mit einem ANMT-Konstrukt beobachtet werden können. Durch die unerwartet hohe Ähnlichkeit der ANMT zu OMTn, wird zusätzlich die Bedeutung der ANMT-Isolation für die evolutionäre Betrachtung von MTn deutlich.

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