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Titel:mRNA Expression elektrolytregulierender Proteine an der Maus
Autor:Ludewig, Christoph Michael
Weitere Beteiligte: Nüsing, Rolf (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2007
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2007/0626
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2007-06265
DOI: https://doi.org/10.17192/z2007.0626
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):mRNA expression of electrolite-regulated proteins on a mouse
Publikationsdatum (Online):2007-10-29

Dokument

Schlagwörter:
Bartter-Syndrom, Elektrolyt, Bartter-Syndrome, mRNA Expression

Zusammenfassung:
Das Hyperprostaglandinsyndrom (HPS), auch antenatales Bartter-Syndrom genannt, stellt eine Salzverlusttubulopathie dar, die durch Mutationen in den Genen für die Proteine NKCC2, ROMK, Barttin oder ClC-Kb hervorgerufen werden kann. Klinisch ist ein massiver Salzverlust zu beobachten, der einhergeht mit stark erhöhter Reninaktivität (aktiviertes RAAS) und einer hohen PGE2-Ausscheidung. Unbe-handelt führt diese Erkrankung zum Tod des Kindes. Durch lebenslange Gabe eines Prostglandinsynthese-Hemmers, wie dem Indomethacin, und ausreichende Salz- und Wasseraufnahme, ist eine wesentliche Unterdrückung der Symptomatik zu erreichen. Verschiedene Arbeiten weisen auf eine pathogenetische Rolle des Enzyms COX-2 (verantwortlich für die PGE2-Bildung) und des PGE2-Rezeptorsubtyps EP4 hin. Die Erkrankung des HPS wurde im Tiermodell durch die Gabe des NKCC2-Hemm-stoffs Furosemid, einem Schleifendiuretikum, simuliert. Dieses wurde über 10 Tage mittels Trinkwasser kontinuierlich zugeführt. Ziel der Arbeit war, Expressionsver-änderungen verschiedener Proteine, die am Elektrolyttransport der Niere beteiligt sind, zu untersuchen. Diese Untersuchungen wurden an C57Bl6-Wildtypmäusen ver-gleichend zu COX-2- und EP4-Knockout-Mäusen durchgeführt. Die Nieren behandelter und nichtbehandelter Tiere (Gruppengröße n=12) wurden entnommen, die RNA isoliert und anschließend die mRNA der Proteine NKCC2, ROMK, KCC1, 3, 4, ClC-K1, NCCT, Na+-K+-ATPase, ENaC β und γ, SGK und Nedd-4 mittels PCR-Technik untersucht. Die relative mRNA-Expression wurde auf die von GAPDH normiert. Die durchgeführten Analysen zeigen, dass NKCC2, ROMK, sowie die Kalium-chloridkanäle KCC1, 3, 4 und auch NCCT unter der Gabe von Furosemid bei den Wildtypmäusen (C57Bl6), herunterreguliert wurden, bei den COX-2-/- Mäusen hingegen waren die mRNA-Konzentrationen nicht erniedrigt, beim ROMK-Kanal waren sie sogar erhöht. Diese Beobachtung weist auf eine Expressionsregulation über die Cyclooxygenase-2 und PGE2 hin und dies könnte zum klinisch beobachteten Wasser- und Salzverlust beitragen. Untersuchungen an EP4-/- Mäusen weisen darauf hin, dass diese PGE2-abhängige Regulation, außer im Fall von KCC1, 3 und 4, über den EP4 Rezeptor vermittelt wird.Ein anderes Bild ist für die Expression des Natriumkanals ENaC zu beobachten. Die untersuchten β- und γ- Untereinheiten zeigen unter der Gabe von Furosemid eine Zunahme der mRNA-Konzentrationen beim Wildtyp, während sich bei den COX-2-/- Mäusen keine signifikanten Änderungen zeigen. Erstaunlicherweise war bei den EP4-Rezeptor-/- Mäusen ein deutlicher Abfall der β-Untereinheit zu verzeichnen, während bei der γ-Untereinheit kein Unterschied nachzuweisen war. Es ist bekannt, dass infolge des Ausfalls bzw. der Hemmung von NKCC2 oder ROMK ein erhöhter renaler Wasser- und Salzverlust aufgrund mangelnder Konzen-trierungsfähigkeit im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife vorliegt. Außer-dem wird vermutet, dass aus dem gleichen Grund im juxtaglomerulären Apparat, über die verminderte Chloridkonzentration, die COX-2 und die Reninexpression gesteigert wird. Würden nun die ohnehin gehemmten oder vermindert exprimierten Kanäle noch zusätzlich über COX-2 herunterreguliert, wie es die Ergebnisse annehmen lassen, wäre ein Circulus vitiosus von erniedrigter Kanalkonzentration

Summary:
The hyperprostaglandin E syndrome (HPS), which is also known as antenatal Bartter syndrome, is a salt loss tubulopathy, evoked by mutations in the genes of the proteins NKCC2, ROMK, Barttin or ClC-Kb. Clinically, a massive salt loss can be seen, accompanied by enormously increased renin activity (activated RAAS) and high prostaglandine E2 (PGE2) excretion. If not treated, this disease leads to the death of the affected child. By lifelong administration of a prostaglandin synthesis inhibitor, like Indomethacin, and sufficient salt and water intake, considerable suppression of the symptoms can be achieved. Different papers point out a pathogenetic role of the enzyme COX-2 (responsible for the generation of PGE2) and the PGE2 receptor-subtype EP4. In this study, the HPS was simulated in an animal model, by administering the NKCC2-inhibitor furosemide, a loop diuretic. It was mixed into the drinking water for ten days. The aim of this dissertation was to investigate the modifications of expression of different proteins, which are involved in the transport of electrolytes in the kidney. These investigations were carried out on C57Bl6 wildtype mice compared to COX-2 and EP4 knockout mice. The kidneys of treated and untreated animals (n = 12) were extracted and the RNA was isolated. Afterwards, the mRNA of the proteins NKCC2, ROMK, KCC1, 3, 4, ClC-K1, NCCT, Na+-K+-ATPase, EnaC β and γ, SGK and Nedd-4 was examined using the PCR-technique. The relative expression of mRNA was standardized to that of GAPDH. The results of the analysis show that NKCC2, ROMK, as well as the potassium-chloride-channels KCC1, 3, 4 and NCCT were downregulated by administering furosemid to C57Bl6-mice, while the mRNA concentrations of the COX-2-/- mice were not decreased and in the case of ROMK even increased. These observations indicate that the expression is regulated by Cyclooxygenase-2 and PGE2 and that this could be one of the reasons for the clinically seen salt and water loss. The investigations of the EP4-/- mice allow the assumption that this PGE2 related regulation could be mediated by the EP4 receptor, with the exception of KCC1, 3, 4. The results are different in terms of the ENaC channel. The investigated subunits β and γ show an increase of the mRNA-concentrations in the wildtype mice when furosemide is given, however there were no significant differences for the COX-2-/-mice. Astonishingly, a significant β subunit decrease of EP4-receptor-/- mice could be noticed whereas the γ-subunit expression remained stable. It is postulated that there is an increased water and salt loss caused by the deficit or the inhibition of NKCC2 or ROMK which leads to inadequate ability for urine to concentrate in the thick ascending limb of Henle. Furthermore, it is suspected that, for the same reason, the expression of COX-2 and renin in the juxtaglomerular apparatus is increased by a decreased chloride concentration. If the already decreased or inhibited exprimated channels were additionally downregulated by COX-2, as could be supposed according to the previous results, there would be a circulus vitiosus of decreased channel concentration


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