Entwicklung eines miniaturisierten elektrophoretischen Analysensystems auf Keramikbasis zur Bestimmung von Polyphenolen.

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines LTCC-Mikrochips als kapillarelektrophoretisches Trennsystem für „Lab-on-a-chip“-Applikationen. Innerhalb eines Verbundprojektes wurde eine Apparatur zu konstruieren, mit deren Hilfe sich elektroaktive Substanzen nach kapillarelektrophoretischer Auftrennu...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Goldbach, Marc
Beteiligte: Keusgen, Michael (Prof.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2006
Pharmazeutische Chemie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines LTCC-Mikrochips als kapillarelektrophoretisches Trennsystem für „Lab-on-a-chip“-Applikationen. Innerhalb eines Verbundprojektes wurde eine Apparatur zu konstruieren, mit deren Hilfe sich elektroaktive Substanzen nach kapillarelektrophoretischer Auftrennung in LTCC-Mikrochips amperometrisch detektieren lassen. Gemische von bis zu drei Polyphenolen konnten elektrochemisch detektiert und auf Grund ihrer Migrationszeiten getrennt werden. Verglichen mit einem publizierten LTCC-System (Henry et. al., 1999) waren die Standardabweichung der berechneten Migrationszeiten und effektiven elektrophoretischen Geschwindigkeiten etwa 7 bis 10 % größer. Ein weiterer Nachteil waren die großen Peakbreiten. Diese Nachteile können zahlreiche Ursachen besitzen: 1) Durch die Laminierung lässt sich die Arbeitselektrode nicht genau vor den Kapillarausgang positionieren. Schrumpfungseffekte können diesen Prozess verstärken. Ist die Elektrode zu nah an dem Ausgang positioniert, kommt es zu Fluktuationen in der Trennspannung und zu einer Abnahme der Sensitivität. Andererseits führt ein zu großer Abstand zu Diffusionseffekten, die ebenfalls zur Bandenverbreiterung beitragen. Abhilfe schafft hier möglicherweise eine neue Sintertechnologie mit geringerem Schrumpfungsfaktor. 2) Eine andere Möglichkeit für die geringere Trenneffizienz ist die Größe der Probenzone. Durch die Konstruktion eines speziell auf µTAS-Anwendungen angepassten Hochspannungsnetzgerätes wurde die elektrokinetische Injektion so modifiziert, dass nur wenige Nanoliter der Probenlösung benötigt wurden. Dennoch wurden eine Bandenverbreiterung und eine geringe Auflösung der Peaks beobachtet. Bei der pinched-Injektion kann ein langsames Umschalten der angelegten Potentiale zu einer großen Probenzone führen. Die Probe ist dann nicht in diskreten, genau definierten Zonen geschichtet. Dies ist wahrscheinlich auf konstruktionsbedingte Effekte zurückzuführen, die ein Nachlaufen der Probenlösung aus den Seitenkapillaren bewirken. Mikroskopische Aufnahmen zeigten, dass die Kanten im Kreuzungsbereich der Kapillaren stark abgerundet waren. Eine exakte Potentialtrennung ist dadurch zwischen den einzelnen Kapillaren nicht mehr möglich. Durch das mechanische Stanzen der Kapillaren kommt es zu unebenen Wandstrukturen nach Laminierung und Sintern besonders in der Kreuzungszone. Dies kann auch zu einer Beeinflussung des elektroosmotischen Flusses führen. Durch den Einsatz neuer Lasertechnik (NeodymYAB-Laser) sollten diese Inhomogenitäten ausgeschlossen werden. Die Proben wurden durch eine elektrokinetische Methode injiziert und amperometrisch detektiert. Die Nachweisgrenze lag je nach Polyphenol zwischen 12,5 µmol und 100 mM. Obwohl Bandenverbreiterung zu einer Abnahme der Trenneffizienz führt, konnte ein Gemisch aus Dopamin, Pyrogallol und Gallussäure in LTCC-Mikrochips eindeutig getrennt und amperometrisch detektiert werden. Migrationszeit und –geschwindigkeit waren mit den Einzelmessungen vergleichbar. Ebenso Höhe und Breite der Peaks. Für die Detektion von Polyphenolen in matrixreichen Realproben ist eine höhere Spezifität erforderlich. Um dies zu erreichen, wurden Versuche zur Integration phenoloxidierender Enzyme in das mikrofluidische Trennsystem durchgeführt. Dabei wurden Modellsysteme erarbeitet, die für eine spätere Immobilisierung auf einer Goldelektrode dienen. Die Überprüfung der Funktionalität immobilisierter Enzyme erfolgte photometrisch mittels geeigneter Substrate. Je nach Enzym waren unterschiedliche Oberflächen geeignet, diese so zu immobilisieren, dass keine Beeinflussung der Bindungstasche vorlag. Bei der Immobilisierung auf nicht funktionalisierten Goldträgern wurden teilweise die höchsten Absorptionen gemessen. Dabei ist jedoch die Stabilität der Bindung, insbesondere im Hinblick auf die Verwendung in einem Durchflusssystem, zu berücksichtigen. Die anschließende photometrische Überprüfung der Enzymaktivität mit Hilfe eines Farbassays war bei allen Immobilisierungsmethoden anwendbar. LTCC ist als Material für die Entwicklung von „Lab-on-a-chip“-Anwendungen geeignet. Die zu Glas vergleichbaren Eigenschaften, wesentlich kostengünstigere und einfachere Herstellung machen diese niedrig sinternde Keramik zu einem idealen Ersatz bestehender Mikrochip-Applikationen. Die durchgeführten Versuche waren vielversprechend. Änderungen in der Herstellung und Konstruktion der LTCC-Mikrochips sollten zur Minimierung der erwähnten Nachteile führen. Der Absatzmarkt in der medizinischen und pharmazeutischen Industrie ist enorm und der Bedarf an kleinen, transportablen Analysengeräte mit einfacher Bedienung wird in den kommenden Jahren weiter zunehmen.