Dokument 1

Prüfsumme (MD5)

Kurzfassung in Deutsch:
Eisen-Schwefel- (Fe/S) Cluster sind anorganische Cofaktoren zahlreicher Proteine und ubiquitär in allen Organismen zu finden. Fe/S Proteine übernehmen wichtige Aufgaben beim Elektronentransport, in der Genregulation und in Enzymkatalysen. In Eukaryoten wird die Reifung dieser Proteine von drei komplexen Maschinerien übernommen. Die in der mitochondrialen Matrix lokalisierte ISC- (iron-sulfur cluster) Assemblierungsmaschinerie ist an der Reifung aller zellulären Fe/S Proteine beteiligt. Demgegenüber übernehmen die mitochondriale ISC-Export- und die cytosolische CIA- (cytosolic iron-sulfur protein assembly) Maschinerie eine spezifische Funktion in der Reifung extra-mitochondrialer Fe/S Proteine. In den letzten vier Jahren wurden insgesamt sechs Proteine der CIA-Maschinerie identifiziert. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte die essentielle P Loop NTPase Nbp35 aus Saccharomyces cerevisiae als Komponente der CIA-Maschinerie nachgewiesen werden. Die Depletion von Nbp35, durch regulierte Genexpression, führte zur verminderten Aktivität des cytosolischen Fe/S Proteins Isopropylmalat-Isomerase (Leu1). Demgegenüber wurden mitochondriale Fe/S Proteine nicht beeinflusst. Starke Defekte in der de novo Reifung von extra-mitochondrialen Fe/S Proteinen belegten die spezifische Beteiligung von Nbp35 an der Biogenese dieser Fe/S Proteine. Nbp35 bindet am N-Terminus selbst einen Fe/S Cluster, zu dessen Assemblierung die ISC- und CIA Maschinerien benötigt werden. Die gestörte Biogenese von Fe/S Proteinen hat eine erhöhte Eisenakkumulation in den Mitochondrien sowie die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren Aft1/Aft2, den Hauptregulatoren der Eisenhomeostase in Hefe zur Folge. Diese Auswirkungen sind spezifisch auf Defekte in den beiden mitochondrialen ISC-Maschinerien zurückzuführen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden deshalb die genom-weiten Auswirkungen von Depletionen der drei Fe/S Protein-Assemblierungsmaschinerien durch Transkriptom-Analysen untersucht, um vergleichende Einblicke in die Konsequenzen funktioneller Defekte der Fe/S Protein-Biogenese zu erhalten. Dazu wurden Hefe-Mutanten verwendet, in denen das Ferredoxin Yah1 (ISC Assemblierung), der ABC-Transporter Atm1 (ISC-Export) oder Nbp35 (CIA) als repräsentative Mitglieder der drei Biogenese-Maschinerien depletiert wurden. Die Transkriptionsprofile Nbp35-depletierter Zellen zeigten nur wenige differentiell exprimierte Gene. Keines dieser Gene weist auf eine Verbindung zur Eisenhomeostase hin. Demzufolge übt die CIA-Maschinerie überraschenderweise keinen Einfluss auf die Eisenhomeostase aus. Somit wurde eine frühere Hypothese widerlegt, nach der die Eisenhomeostase über ein cytosolisches Fe/S Protein vermittelt wird. Die Depletion von Atm1 und Yah1 ist dagegen mit einer umfassenden sowie weitgehend überlappenden Änderung des Genexpressionsmusters verbunden, welches u.a. die Induktion Aft1/Aft2-abhängiger Gene und die Reprimierung von Genen, die für Komponenten der mitochondrialen Atmungskette kodieren, beinhaltet. Weitere transkriptionelle Veränderungen betrafen die Ergosterol- und Biotin-Synthese, den Aminosäurestoffwechsel sowie Gene, die für Proteine der Synthese oder des Abbaus von Häm oder für Häm-haltige Proteine kodieren. Insgesamt ähneln die Transkriptionsprofile Atm1- und Yah1-depletierter Zellen dem einer Eisen-depletierten Zelle. Unterstützt wurden diese Beobachtungen durch Promotoranalysen und Northern Blots an ausgewählten Eisen-abhängigen Genen [z.B. ERG3 (Ergosterol-Biosynthese), BIO2 (Biotin-Synthese) und HEM15 (Häm-Biosynthese)]. Demnach signalisiert die Depletion von Yah1 und Atm1 und damit die reduzierte Synthese von zellulären Fe/S Proteinen offensichtlich der Zelle einen Eisenmangel. Die Daten legen nahe, dass die Mitochondrien als Orte der Fe/S Cluster- und Häm-Biogenese entscheidend an der Regulation der zellulären Eisenhomeostase beteiligt sind. Interessanterweise besitzt die Häm-Biosynthese in Hefe keinen vergleichbaren Einfluss auf die Eisenhomeostase. Nach einer vorläufigen Modellvorstellung könnte die ISC-Assemblierungs- und Exportmaschinerie an der Synthese und dem Export einer (noch unbekannten) Komponente beteiligt sein, die neben einer Funktion in der Reifung extra-mitochondrialer Fe/S Proteine auch an der Inhibierung von Aft1 als Transkriptionsaktivator beteiligt ist. Zusätzlich könnte diese Komponente weitere Stoffwechselwege (z.B. Respiration, Häm-Synthese), in denen Eisen benötigt wird, regulieren. Bereits aus früheren Arbeiten war bekannt, dass ein Funktionsverlust der mitochondrialen ISC-Maschinerien zusätzlich mit einem Häm-Defekt einhergeht, der den Aktivitätsverlust Häm-haltiger Proteine in Yah1- und Atm1-depletierten Zellen erklärt. Der Häm-Mangel basiert zum einen auf der reversiblen Inhibierung der Ferrochelatase (Hem15p). In dieser Arbeit konnte des Weiteren gezeigt werden, dass das HEM15 Gen in Yah1-, Atm1- sowie in Eisen-depletierten Zellen transkriptionell reprimiert wird.

Kurzfassung in Englisch:
Iron-sulfur clusters are inorganic cofactors of numerous proteins found in all organisms. Fe/S proteins are involved in electron transport, enzyme catalysis and regulation of gene expression. In eukaryotes, the biosynthesis of Fe/S proteins requires three proteinaceous machineries. Mitochondria harbour an iron-sulfur cluster (ISC) assembly machinery which is responsible for the maturation of all cellular Fe/S containing proteins. In addition, maturation of extra-mitochondrial Fe/S containing proteins in Saccharomyces cerevisiae depends on a so far unknown substrate, produced by the ISC assembly machinery and exported via the ABC transporter Atm1 (ISC export machinery) into the cytosol. The substrate is required by the cytosolic ISC assembly (CIA) machinery to assemble Fe/S clusters on extra-mitochondrial target proteins. In the past four years six CIA proteins were identified and exhibited a crucial function in extra-mitochondrial Fe/S protein biogenesis. The first part of this work presents the identification and characterization of the CIA component Nbp35, a soluble P-loop NTPase. The protein resides in the cytoplasm and a small amount is present in the nucleus. Depletion of Nbp35 strongly impairs the activity of the cytosolic Fe/S protein Leu1 (Isopropylmalate-Isomerase), whereas mitochondrial Fe/S proteins are unaffected. Moreover, defects in the de novo maturation of various cytosolic and nuclear Fe/S proteins were observed in the absence of Nbp35, demonstrating the functional involvement of Nbp35 in the biogenesis of extra-mitochondrial Fe/S proteins. Nbp35 shows sequence similarity to Cfd1, both proteins form in vitro and in vivo a hetero-oligomer. Nbp35 contains a 4Fe/4S cluster at its N-terminus coordinated by four conserved cysteine residues. Maturation of Nbp35 depends on the mitochondrial ISC and CIA machineries. Hence, Nbp35 is involved in its own maturation. To determine the precise molecular function of Nbp35 further biochemical investigations will be necessary. It has been reported that disruption of the Fe/S cluster biogenesis is associated with mitochondrial iron overload and activation of the iron-sensing transcription factors Aft1/Aft2. These effects are due to defects in the mitochondrial ISC machineries, not the cytosolic CIA machinery. To investigate the cellular consequences of defective Fe/S cluster biogenesis in S. cerevisiae, strains depleted of yeast adrenodoxin homolog Yah1 (ISC assembly), the ABC transporter Atm1 (ISC export) and the soluble P-loop ATPase Nbp35 (CIA) were used. Transcriptional changes were analysed by genome-wide DNA microarray experiments. The analysis revealed a strong and largely similar transcriptional response of yeast cells depleted for the mitochondrial ABC transporter Atm1 or yeast adrenodoxin Yah1, whereas the transcriptional response to Nbp35 depletion was minimal. The Nbp35 mutant showed no effect on iron homeostasis. Therefore, it could conclude that the CIA machinery has no impact on cellular iron homeostasis. The results refute an earlier suggestion that iron regulation in yeast is mediated by a cytosolic Fe/S protein. In addition, this observation indicates that the regulation of cellular iron homeostasis is crucially controlled by mitochondria. In contrast to Nbp35 depletion the absence of Yah1 and Atm1 depletion induced the expression of Aft1/Aft2 dependent genes and the repression of genes involved in respiration. Moreover, genes involved in the synthesis of ergosterol, biotin, amino acid biosynthesis and the degradation and synthesis of heme display an altered gene expression. Hence, depletion of Atm1p und Yah1 and the disruption of cellular Fe/S protein biogenesis signal an intracellular iron-limitation. Data were confirmed by promoter studies and northern blots using selected iron-dependent genes such as ERG3 (ergosterol-biosynthesis), BIO2 (biotin-biosynthesis), and HEM15 (heme-biosynthesis). Interestingly, heme-biosynthesis does not have a similar impact on iron homeostasis. This means that the ISC assembly and export machinery could be involved in the production of a so far unknown component, necessary for maturation of Fe/S proteins and inhibition of the iron-sensing transcription factor Aft1. In addition, this component could be involved in the regulation of further iron consuming metabolic processes (e.g. respiration, heme-synthesis). Previous studies already demonstrated that disruption of the ISC machinery is accompanied by a heme-defect, which could explain the loss in activity of heme-containing proteins. Decreased heme-pools in absence of Atm1, Yah1 and under iron-deplete conditions are due to repression of the HEM15 gene encoding a ferrochelatase. Furthermore, previous studies show a biochemical inhibition of the ferrochelatase. The microarray data revealed a general cross-talk between mitochondrial Fe/S cluster assembly and the biosynthesis of heme.

Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten