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Titel:Kombinierte Rasterkraft-, Zugkraft und Fluoreszenzmikroskopie zur Analyse der Mechanotransduktion in Osteoblasten
Autor:Mennenga-Klopp, Erk
Weitere Beteiligte: Hofmann, Martin (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2005
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2006/0233
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2006-02330
DOI: https://doi.org/10.17192/z2006.0233
DDC: Physik
Titel (trans.):Combined atomic-force, traction-force and fluorescence-microscopy for the investigation of the mechanotransduction in bone cells
Publikationsdatum:2006-04-11
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Rasterkraftmikroskopie, Zellskelett, Osteoblast, Mechanics of cells, Bone cells, Fluoreszenzmikroskopie, Atmoic force microscopy, Traction force microscopy, Calciumion, Calcium, Zugkraft-Messungen, Zellmechanik, Osteoporose, Mechanorezeptor, Osteoporose, Zelle, Osteozyt, Mechanotransduction, Osteoporotic desease, Knochenzellen, Mechanotranduktion

Zusammenfassung:
Die vorliegende Doktorarbeit wurde durch die interdisziplinäre Zusammenarbeit der Fachbereiche Physik und Medizin der Philipps-Universität Marburg sowie dem Institut für Werkstoffe und Nanoelektronik in Bochum realisiert. Ziel der Arbeit war es, zelluläre Vorgänge im Knochen zu analysieren und damit das Verständnis des krankhaften Knochenschwundes, der Osteoporose, auf makroskopischer Ebene zu vertiefen. Hierbei stand die Untersuchung der Mechanotransduktion von Osteoblasten mit Hilfe der Rasterkraft- und Zugkraftmikroskopie, sowie diverser Methoden der Fluoreszenzmikroskopie im Mittelpunkt. Mittels dieser Techniken konnten neue Erkenntnisse hinsichtlich der Rezeption mechanischer Reize auf zellulärer Ebene sowohl aus biologischer, als auch aus physikalischer Sicht gewonnen werden. Darüber hinaus wurde das zellmechanische Verhalten unter äußeren Kräften analysiert und auf der Basis der hierbei gewonnenen experimentellen Ergebnisse ein neues zellmechanisches Modell postuliert. Um die gezielte mechanische Stimulation einzelner Knochenzellen zu ermöglichen, wurden im Rahmen dieser Arbeit ein dreidimensionales Kraftmikroskop, sowie eine neue Beleuchtungsquelle für Verhältnismessungen mit Fluoreszenzfarbstoffen entwickelt. Durch die Weiterentwicklung der Zugkraft-Mikroskopie konnte ein tieferer Einblick in das zellmechanische Verhalten unter externen Belastungen gewährt werden. Wie frühere Untersuchungen der Mechanotransduktion in Osteoblasten zeigten, wird nach Applikation von Scherflüssen und Dehnungsreizen ein spezieller Mechanotransduktionsweg initiiert, der eine verzögerte Calciumantwort vermittelt durch die Aktivierung der Phospholipase C (PLC) hervorruft. In dieser Arbeit stellte sich jedoch heraus, dass die lokale Stimulation von Osteoblasten mit dem Kraftmikroskop - unabhängig von den Stimulationsparametern Frequenz, Amplitude und Zyklenanzahl - keine Calciumantworten auslöst. Weder die Aktivierung der PLC, noch das Öffnen mechanosensitiver Ionenkanäle waren zu beobachten. Ein spezieller Mechanosensor, der für die Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentation verantwortlich sein könnte, wird also durch die lokale Stimulation nicht beeinflusst. Beide Stimulationsarten - Dehnungsreize und lokale Stimulationen mit dem Kraftmikroskop - haben gemeinsam, dass sie eine spontane Änderung der auf ein Substrat übertragenen zellulären Adhäsionskräfte von Osteoblasten hervorrufen. Die lokalen Stimulationen verursachen darüber hinaus einen langsamen Anstieg oder Abfall der zellulären Adhäsionskräfte. Insgesamt sind die aktiven Zellantworten von der intrazellulären Calciumkonzentration unabhängig. Die Ergebnisse der Calcium- und Zugkraftmessungen zeigten, dass durch äußere Belastungen verschiedene intrazelluläre Signalkaskaden und damit möglicherweise unterschiedliche Mechanosensoren der Zelle aktiviert werden können. Hierbei hängt die zelluläre Reaktion von der Art des mechanischen Reizes ab. Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass die Aktivierung der zellmechanischen Antworten und in Folge die Art einer speziellen Mechanotransduktion von der Frequenz der lokalen Stimulation abhängig ist - ein Phänomen, das auch bei der Stimulation von Knochenfragmenten beobachtet werden konnte. Um zu klären, warum die zelluläre Antwort der Osteoblasten auf unterschiedliche mechanische Reize variiert, wurde die Kraftweiterleitung innerhalb der Zelle mit Hilfe von Zugkraftmessungen bestimmt. Während Dehnungsreize die Adhäsionsseite der Zelle global beeinflussen, sind lokale Reize dazu nur bedingt in der Lage. Die Vermutung, dass ein Mechanosensor in der Nähe der Adhäsionspunkte oder des Zytoskeletts lokalisiert ist, erhält damit weitere Bestätigung und liefert eine Erklärung für das beobachtete Phänomen der divergierenden Zellantworten. Schlussendlich spielt vermutlich für die Induzierung der Knochensynthese die direkte Übertragung der Knochendeformation auf die Knochenzellen eine wichtige Rolle, während der durch hydrostatischen Druck verursachte Flüssigkeitsfluss in den Knochenkanälchen zu vernachlässigen ist. Da die experimentellen Ergebnisse dieser Arbeit den gängigen zellmechanischen Modellen widersprechen, wird in dieser Arbeit ein kombiniertes zellmechanisches Modell postuliert, dass das physiologische Verhalten der Zelle besser beschreibt. Jedoch ist die weitere Erforschung der Mechanotransduktion zum Verständnis der Knochensynthese eminent wichtig und es sollte mit weiterführenden Experimenten an die Ergebnisse dieser Arbeit angeknüpft werden. Im Vordergrund steht dabei die Weiterentwicklung des Kraftmikroskops zu einem System, das Experimente in Kombination mit der konfokalen Mikroskopie ermöglicht. Eine solche Apparatur könnte dazu dienen, mit Hilfe von Transfektionstechniken die Morphologie der Zellen unter mechanischer Stimulation zu beobachten und auf diesem Weg eine weiterführende Analyse der zellmechanischen Prozesse ermöglichen. Es bleibt zu hoffen, dass die Fortführung dieser interdisziplinären Forschung in naher Zukunft neue Ansätze zur Therapie des krankhaften Knochenschwundes hervorbringt.


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