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Zusammenfassung:
Die Akkumulation von kompatiblen Soluten ist ein weit verbreiteter Schutzmechanismus gegen variierende Umweltbedingungen und wird in vielen Spezies der Bacteria und Archaea verwendet. Das einige kompatible Solute nicht nur osmoprotektive Wirkung haben, sondern generell Protein-stabilisierende Substanzen sind, ist durch in vitro Experimente belegt. Der Protein-stabilisierende Effekt wird in dem „preferential exclusion model“ beschrieben und beruht auf dem thermodynamisch begründeten, bevorzugten Ausschluß der Solute von der Oberfläche der Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurden die Substratbindeproteine zweier hochaffiner ABC-Transporter für die kompatiblen Solute Glycin Betain und Prolin Betain auf molekularer Ebene untersucht, um die Grundlagen zur Bindung von „bevorzugt ausgeschlossenen Soluten“ zu beschreiben. Dazu wurden die beiden hochaufgelösten Kristallstrukturen der Substratbindeproteine aus dem ProU-System von E. coli (EcProX, 1,6 Å) und dem ProU-System von A. fulgidus (AfProX 1,9 Å) verwendet. In EcProX wird das quartäre Amin des gebundenen Glycin Betains durch eine Box von drei Tryptophanen koordiniert (Trp-65, Trp-140 und Trp-188), die Carboxylgruppe des Glycin Betains wird durch H-Brücken stabilisiert. In einer Mutagenestudie konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Kation-pi-Interaktionen eine Haupt-Determinante in der Bindung von Glycin Betain sind. Es konnte gezeigt werden, dass neben Tryptophan auch Phenylalanin und Tyrosin zu starken Interaktionen mit dem Substrat fähig sind. Die Mutagenesestudie demonstrierte eine unterschiedlich starke Beteiligung der Tryptophane an der Substratbindung. Trp-188 ist dabei essentiell für die Bindung von Glycin Betain, Trp-140 zeigte die geringste Beteiligung. Trp-188 benötigt die Tryptophane Trp-140 und Trp-65 aber zur Stabilisierung des quartären Amins von Glycin Betain in der Bindetasche. Das AfProX Protein zeigt in Affinitätsmessungen eine besonders hohe Affinität zu Glycin Betain und Prolin Betain. Verglichen mit dem EcProX Protein ist die KD von AfProX zu Glycin Betain bei 50°C (0,01 µM) um den Faktor 100 niedriger als die des EcProX Proteins bei Raumtemperatur (KD=1µM) und um den Faktor 1000 niedriger verglichen zum OpuAC Protein (KD=17 µM), einem Glycin Betain und Prolin Betain bindenden Protein aus B. subtilis. In der Kristallstruktur von AfProX zeigte sich eine weitere Konstellation einer aromatischen Bindetasche. Das quartäre Amin wird dort von den vier Tyrosinen Tyr-63, Tyr-111, Tyr-190 und Tyr-214 (Tyrosin-Gürtel) und einem Aspartat koordiniert, die Carboxylgruppe wird durch Salz- und H-Brücken stabilisiert. Eine Mutagenesestudie zeigte auch hier die wichtige Beteiligung von Kation-pi-Interaktionen an der hochaffinen Bindung dieser kompatiblen Solute. Dabei ist die besondere Architektur des Tyrosin-Gürtels, zusammen mit den Carboxylgruppen-stabilisierenden Aminosäuren, essentiell für die hohe Bindeaffinität. Je nach Position des Tyrosins kann der Austausch eines Tyrosins gegen ein Alanin das Absinken der Bindekonstante auf einen Wert, vergleichbar zu dem des EcProX- oder des BsOpuAC-Proteins, oder niedriger bewirken. Ein Austausch von zwei Tyrosinen gegen Alanin bedeutet immer einen kompletten Verlust der Bindeaffinität. Datenbankanalysen der Aminosäuresequenzen von EcProX, AfProX und BsOpuAC zeigten eine weite Verbreitung der konservierten Bindemotive der Proteine und im Falle von BsOpuAC eine besonders starke Konservierung der bindungsrelevanen Tryptophane („Trp-Prisma“) sowie einen Domänentausch im Vergleich zu anderen Glycin Betain Bindeproteinen. Die Entdeckung eines Substratbindeprotein-abhängigen ABC-Transporters (Ehu) für Ectoin und Hydroxyectoin in S. meliloti erlaubte die Analyse der Ectoin-Bindung durch ein Substratbindeprotein. Nach der Überproduktion, Reinigung und Charakterisierung des hochaffinen Ectoin-Bindeproteins (EhuB) und dessen Kristallistation mit gebundenem Ectoin (und Hydroxyectoin) zeigte die Struktur (Auflösung 2,1 Å) in der Substratbindestelle eine aromatische Box aus zwei Phenylalaninen und einem Tyrosin, welche die delokalisierte positive Ladung des Moleküls binden. Der Pyrimidinring und die Carboxylgruppe des Ectoins werden durch Salz- und H-Brücken stabilisiert. Kation-pi-Interaktionen sind eine Hauptdeterminate in der hochaffinen Bindung von Glycin Betain und Prolin Betain, aber auch von Ectoin und Hydroxyectoin und finden eine weite Verbreitung in den Bacteria und Archaea.

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