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Summary:
Die chemisch schwierige Decarboxylierung von 4-Hydroxyphenylacetat zu p-Kresol wird durch das Enzym 4-Hydroxyphenylacetat-Decarboxylase (4-Hpd) katalysiert. Dieses Enzym wurde gereinigt und als Prototyp einer neuen Gruppe innerhalb der Glycylradikalfamilie (GREs) charakterisiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass dieses System in C. difficile Eigenschaften aufweist, die es von den gut untersuchten Systemen Pyruvat Format Lyase (Pfl) und anaerobe Ribonucleotid Reduktase (Nrd) unterscheiden. In dieser Arbeit wurden ähnliche Gene aus Clostridium scatologenes (Csd) und Tannerella forsythensis (Tfd) kloniert und in Escherichia coli exprimiert. Die rekombinanten Enzyme wurden gereinigt und vorläufig charakterisiert. Die rekombinanten Decarboxylasen konnten als Hetereokotamere (HpdBC und CsdBC) oder Heterotetramerer (TfdBC) gereinigt werden, waren aus großen (B) und kleinen (C) Untereinheiten in äquimolaren Mengen zusammen gesetzt, und enthielten im Gegensatz zu Pfl und Nrd vier Eisen- und vier Schwefel-Atome pro Heterodimer. Während das Csd System 4-Hydroxyphenylacetat-Decarboxylase Aktivität zeigte und sowohl von CsdA als auch von HpdA aktiviert wurde, war das Tfd System unter allen getesteten Versuchsbedingungen inaktiv, zeigte aber eine teilweise Aktivierung zur Glycyl-Radikal-Form. Wurden die große Untereinheiten der einzelnen Decarboxylasen genetisch mit den kleinen Untereinheiten kombiniert, konnten in einigen Fällen lösliche Proteine gereinigt werden. Auch hier betrug das molare Verhältnis der beiden Untereinheiten 1:1 und es konnten Eisen und Schwefel nachgewiesen werden. Allerdings waren die nativen Komplexe dieser Proteine deutlich kleiner und konnten nicht in die Glycyl-Radikal-Form überführt werden. Die rekombinanten Aktivatoren (CsdA bzw. TfdA) waren Monomere und enthielten 7-8 Eisen- und 6-7 Schwefel-Atome pro Monomer, das auf einen zweiten, zusätzlich zu dem aus Pfl und Nrd bekannten, [4Fe-4S]-Kluster schließen ließ. Der im EPR detektierte, katalytisch entscheidende [4Fe-4S]+ Kluster wurde in CsdA und HpdA nachgewiesen, unterschied sich aber von den Signalen des Pfl- Activator sowie des Nrd- Activator; im Gegensatz zu letzteren beeinflusste die Substratbindung das EPR-Signal nicht signifikant. Der Aktivierungsprozess von CsdBC sowie HpdBC mit den jeweiligen Aktivatoren war transient; einem steilen Anstieg an spezifischer Aktivität in etwa 10 Minuten folgte ein langsamerer Inaktivierungsprozess mit einer Halbwertszeit von etwa 30 Minuten. Das hierbei das Glycylradikal verschwindet, konnte durch sauerstoff-induzierte Spaltung den aktiven Decarboxylase mittels SDS-PAGE sowie in EPR Messungen gezeigt werden. Ob diese Inaktivierung durch ein Elektron aus dem zusätzlichen [4Fe-4S]-Kluster des Aktivators verursacht wird oder durch den [4Fe4S]-Kluster der Decarboxylasen vermittelt wird, bleibt Gegenstand aktueller Untersuchungen

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