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Titel:Gentherapeutische Modelle zur anti-angiogenen Therapie experimenteller Tumoren
Autor:Nicolaus, Anke
Weitere Beteiligte: Clauss, Matthias (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2005
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2005/0448
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2005-04480
DOI: https://doi.org/10.17192/z2005.0448
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Models for anti-angiogenic gene therapies of experimental tumors

Dokument

Schlagwörter:
Transciption factor, Avidin-biotin-complex, Endothelium, Tumorangiogenese, Endothel, Transkriptionsfaktor, Gentherapie, Tumor angiogenesis, Drug targeting, Gene therapy, Avidin-Biotin-Komplex, Targeted drug delivery

Zusammenfassung:
Die Entwicklung anti-angiogener Therapien sowie die selektive Wirkstofffreisetzung am Zielort (drug targeting) stellt eine viel versprechende Verbesserung herkömmlicher Therapien zur Behandlung von Krebsleiden dar. Hier wurden die membranständigen Fusionsproteine Lodavin und Scavidin verwendet. Diese bestehen aus Anteilen eines endozytotischen Rezeptors und einer extrazellulären Avidindomäne. Wegen der physikochemischen Eigenschaften von Biotin, die eine Kopplung an Chemotherapeutika oder Radionuklide zulassen, sowie dessen außergewöhnlich hohen Affinität zu Avidin, könnten die Fusionsproteine im Rahmen gentherapeutischer Anwendungen von klinischem Nutzen sein. Aufgrund der starken und transienten endothelzellspezifischen Expression von Flk-1 während der Tumorangiogenese wurden die regulatorischen Elemente des flk-1 Gens für die Expression der Fusionsproteine in transgenen Mäusen verwendet. Die Flk-1-Lodavin und Flk-1-Scavidin transgenen Tiere zeigten eine spezifische endotheliale Expression beider Fusionsproteine in allen Organsystemen während der Embryonalentwicklung, die zu keinerlei phänotypischen Veränderungen führten. Adulte transgene Tiere wiesen keine Expression der Transgene auf. Einzige Ausnahme waren Gefäße der Milz Flk-1-Lodavin transgener Mäuse. Die Analyse experimenteller BFS-1 Fibrosarkome zeigte, dass beide Fusionsproteine während der Neovaskularisierung der Tumoren, die sich in transgenen Tieren entwickelten, exprimiert wurden. Darüber hinaus führte der retrovirale Gentransfer mittels Co-Injektion von BFS-1 Fibrosarkomazellen mit GP+E86 Zellen ausschließlich zur selektiven Infektion einsprossender Gefäße des Tumorstromas nicht aber der Tumorzellen. Zudem wurde ein tumorzellspezifisches Modell etabliert, das eine induzierbare Expression von Scavidin in Fibrosarkomen aufwies. Bindungsstudien mit biotinylierten Liganden wurden an den Modelltieren durchgeführt. Nach systemischer Applikation eines Modellliganden akkumulierte dieser ausschließlich im Lodavin-exprimierenden Zielgewebe. Diese Ergebnisse bestätigen die Funktionalität des Systems als „targeting Modell“ in vivo. In zukünftigen Arbeiten sollen geeignete biotinylierte Konjugate für diagnostische oder therapeutische Anwendungen bei Tumorerkrankungen an den vorgestellten Tiermodellen systematisch ausgetestet werden. Der endotheliale Transkriptionsfaktor Ets-1 spielt eine essentielle Rolle bei der transkriptionellen Regulation wichtiger angiogener Prozesse. Er wird im aktivierten Tumorendothel transient exprimiert und reguliert die Expression an der Angiogenese beteiligter Proteine wie endotheliale Rezeptortyrosinkinasen, Matrixmetalloproteinasen und Adhäsionsmoleküle. Hier wurden Ets-1-abhängige Signalwege blockiert, indem eine dominant negative Transkriptionsfaktormutante von Ets-1 (dnEts-1) überexprimiert wurde. Die dominant-negative Wirkung der Mutante konnte zunächst in vitro durch Inhibierung des Ets-responsiven flk-1 Promotors bestätigt werden. In vivo wurde der retrovirale Gentransfer von dnEts-1 durch Co-Injektion von GP+E86 Zellen mit B16 Melanoma- bzw. BFS-1 Fibrosarkomazellen an syngenen Mäusen durchgeführt. In beiden Tumormodellen konnten trotz Hemmung der Flk-1 Expression keine Veränderungen der Tumorangiogenese oder der Tumorprogression bestätigt werden. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass Ets-1 pleiotrope Funktionen in Endothelzellen ausübt. In zukünftigen Arbeiten sollen zusätzliche Signalwege blockiert werden, da Ets-1 ein Faktor in einem Komplex vieler Transkriptionsfaktoren ist, die die Expression an der Tumorangiogenese beteiligter Gene regulieren. Mögliche Ziele sind die Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF). Ein positiver Einfluss auf eine Vielzahl endothelialer Promotoren konnte speziell für HIF2α demonstriert werden. Zusammen mit Ets-1 wirkt dieser synergistisch bei der Stimulierung der flk-1 Promotoraktivität. Hier wurde die dominant-negative Wirkung einer Deletionsmutante (dnHIF) durch Hemmung des flk-1 Promotors in vitro bestätigt. Retroviren für den dnhif Gentransfer in vivo sollen generiert werden, um HIF-abhängige Signalwege während der Entwicklung experimenteller Tumoren zu blockieren. Die Auswirkung auf die Vaskularisierung von Tumoren auch durch Co-Expression mit dnEts-1, soll in zukünftigen Studien untersucht und als mögliches anti-angiogenes Modell analysiert werden.

Summary:
The development of anti-angiogenic therapy approaches as well as the specific drug release at site of interest (drug targeting) presents a promising advance in conventional anti cancer therapies. In this study, the membrane bound fusion proteins Lodavin and Scavidin were used, consisting of parts of an endocytotic receptor and an extracellular avidin domain. Because of the physicochemical properties of biotin that allow coupling to chemotherapeutics or radionuclides and its exceptional high affinity to avidin, the fusion proteins could be implemented for gene therapeutical and clinical benefit. Due to the strong and transient expression of Flk-1 in endothelial cell during tumor angiogenesis, the regulatory elements of the flk-1 gene were used for the expression of the fusion proteins in transgenic mice. The generated Flk-1-Lodavin and Flk-1-Scavidin transgenic animals showed an endothelial specific expression of both fusion proteins in all organs throughout the embryonic development without any obvious phenotype. Adult transgenic mice showed no expression of the transgenes. Only exception has been vessels of the spleen in Flk-1-Lodavin transgenic mice. Analysis of experimental BFS-1 fibrosarcomas confirmed expression of both fusion proteins during the neovascularisation of tumors grown in transgenic mice. Furthermore, retrovirus-mediated gene transfer of the fusion proteins via co-injection of BFS-1 tumor cells with virus-producing GP+E86 cells resulted in a selective infection of tumor endothelial cells but not of tumor cells. In addition, a tumor cell specific model with an inducible expression of Scavidin was generated. Binding studies has been performed with the animal models. After systemic administration of a biotinylated agent, the ligand accumulated exclusively in the Lodavin-expressing tissue. These results confirm the functionality of the system as an in vivo targeting model. In future studies biotinylated conjugates for diagnostical or therapeutical purposes should be tested systemically in the presented animal models. The transcription factor Ets-1 plays an essential role in the transcriptional regulation of important angiogenic processes. It is expressed transiently in activated tumor endothelial cells and regulates the expression of proteins involved in angiogenesis like endothelial receptor tyrosin kinases, matrix metalloproteinases and adhesion molecules. Here, Ets-1-dependent pathways have been blocked by overexpression of a dominant negative transcription factor mutant of Ets-1 (dnEts-1). Initially, the dominant negative effect of the mutant was confirmed by inhibition of the Ets-responsive flk-1 promoter in vitro. In vivo, retroviral gene transfer of dnEts-1 was performed via co-injection of GP+E86 cells with B16 melanoma or BFS-1 fibrosarcoma cells in syngeneic mice. In both models, no alteration in tumor angiogenesis or tumor progression could be confirmed, although Flk-1 expression was inhibited. These results indicate that Ets-1 exerts pleiotropic functions in endothelia cells. Future studies should be done to block additional pathways, because Ets-1 is only one factor out of a complex that regulates the expression of genes involved in tumor angiogenesis. Possible targets are hypoxia-inducible factors (HIF). A positive influence on the activation of several endothelial promoters involved in angiogenesis has already been demonstrated especially for HIF2α. Together with Ets-1, HIF2α acts synergistically on stimulation of the flk-1 promoter activity. Here, the dominant negative effect of a mutant (dnHIF) was confirmed by inhibition of the flk-1 promoter in vitro. Retroviruses should be generated for the dnhif gene transfer in vivo to block HIF-dependent pathways during development of experimental tumors. Implications on the tumor vascularization also by co-expression with dnEts-1 should be tested in future studies and analyzed as a potential anti-angiogenic model.


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