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Titel: Charakterisierung von Oligomerisierungsdomänen des Marburg-Virus Nukleoprotein und deren funktionelle Bedeutung
Autor: Di Carlo, Andrea
Weitere Beteiligte: Klenk, Hans-Dieter, Prof. Dr.
Erscheinungsjahr: 2004
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0710
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0710
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-07106
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Characterization of oligomerization domains of Marburg virus nucleoprotein and there functional relevance

Dokument

Schlagwörter:
Phosphorylierung, Marburg-Virus, Coiled coils, Oligomerization, Nucleoprotein, Coiled coils, Nukleoprotein, Marburg virus, Phosphorylation, Helix <alpha->, Helix, Viral transcription, Virale Transkription, Oligomerisierung

Zusammenfassung:
Das phosphorylierte Nukleokapsidprotein NP ist Hauptbestandteil des Marburg-Virus (MARV)-Nukleokapsidkomplexes (NC). Neben NP sind drei weitere virale Strukturproteine, VP35, VP30, L, und die genomische RNA in den NC eingebunden. NP, VP35 und L können die virale Transkription und Replikation in einem in vitro Transkriptions/ Replikationssystem vermitteln. NP interagiert mit sich selbst, mit VP35 und VP30. Die Interaktion des NP mit sich selbst (Homooligomerisierung) führt zur Ausbildung von helikalen Strukturen, die das Grundgerüst des NC bilden. In MARV-infizierten Zellen sowie bei rekombinanter Expression des NP lagern sich die NC zu charakteristischen Einschlusskörpern (EK) zusammen. In der vorliegenden Arbeit wurden Homo- und Heterooligomerisierungsdomänen auf dem NP charakterisiert und strukturelle sowie funktionelle Merkmale untersucht. Durch Deletionsmutanten des NP wurden drei wichtige Aminosäurebereiche bestimmt, die die Homooligomerisierung beeinflussen: AS 118-234 (N), AS 320-400 (CC) und AS 522-695 (C). Für CC konnte direkt gezeigt werden, dass dieser Bereich notwendig und ausreichend zur Vermittlung der Homooligomerisierung ist. CC zeigt alle Merkmale zweier Coiled-Coil-Motive (C1: AS 320-50, C2: AS 371-400; CC). Die durch CC-vermittelte Interaktion konnte durch den monoklonalen a-NP Antikörper 2B10 gehemmt werden. Das von diesem Antikörper erkannte Epitop wurde auf die AS 391-410 eingegrenzt. Deletionen von CC zeigten, dass ein intaktes Doppel-Coiled-Coil-Motiv für die NP-abhängige virale Transkription unerlässlich ist. Die Bereiche N und C können miteinander interagieren. Wahrscheinlich findet der Kontakt von N und C intramolekular statt und reguliert die Aktivität von CC. Die kürzeste NP-Mutante, die zur Bildung von Einschlusskörpern fähig ist, umfasst die ersten 270 AS. Wahrscheinlich sind diese AS ausreichend, helikale Nukleokapsidähnliche Strukturen auszubilden, die sich in Einschlusskörpern aneinanderlagern. VP35 bindet in den ersten 390 AS des NP. Die Bindung zwischen beiden Proteinen ist offenbar abhängig von der Kooperation verschiedener NP-Bereiche. Erforderlich, aber nicht ausreichend für die Interaktion zwischen VP35 und NP ist CC. Sowohl die Bindung des NP an sich selbst als auch die Bindung an VP35 sind von der Phosphorylierung eines charakteristischen Serinclusters (AS 450-455) abhängig. Die VP35-Interaktion nimmt mit zunehmender Phosphorylierung des Serinclusters ab. Die Homooligomerisierung ist bei dephosphoryliertem oder komplett phosphorylierten Serincluster gering. Sind einige Serinreste nicht phosphoryliert ist die Homooligomerisierung wildtypisch. Die Phosphorylierung des Serinclusters reguliert auch die Funktion des NP während der viralen Transkription. NP mit dephosphoryliertem oder komplett phosphoryliertem Serincluster vermittelt keine Transkription mehr. Für die Funktion des NP ist unerlässlich, dass einige Serinreste des Serinclusters nicht phosphoryliert sind.

Summary:
The phosphorylated nucleocapsid protein NP is the major component of Marburg virus (MARV) nucleocapsid complex (NC), which further contains the viral structural proteins, VP35, VP30, L, and the genomic RNA. NP, VP35, and L are sufficient to mediate transcription and replication in a minigenome system. NP forms self aggregates and interacts with VP35, and VP30. Intracellularly, NP forms characteristic inclusion bodies that represent places where the helical nucleocapsids are accumulated. In the present thesis NP homo- and heterooligomerization domains were characterized and structural and functional properties were analyzed. Deletion mutants of NP revealed three domains which affected homooligomerization: aa 118-234 (N), aa 320-400 (CC), and aa 522-695 (C). The aa 320-400 displayed all features of two coiled coil motifs (C1: aa 320-50, C2: aa 371-400; CC). The intact two coiled coil motifs were essential for NP dependent viral transcription. The N- (aa 1-234) and C-terminus (aa 522-695) of NP were able to interact. Probably, interaction of N- and C-terminus takes places intramolecularly to regulate the activity of the other oligomerization domains. The shortest NP mutant that was able to form inclusion bodies covered the first 270 aa. It is assumed, that these 270 aa form helical structures which accumulate to inclusion bodies. Binding of VP35 on NP takes place in the N-terminal portion of NP (aa 1-390). The binding intensity to VP35 seems to be dependent on cooperation of various parts of NP. Essential but not sufficient for NP-VP35 interaction are two coiled coil motifs. Majority of phosphorylated serine and threonine residues is located between aa 390-480. In vitro studies revealed that both, homooligomerization and heterooligomerization with VP35 were dependent on phosphorylation state of a characteristic serine cluster (aa 450-455). The interaction with VP35 is inversely related to phosphorylation. Homooligomerization is favored by a moderate phosphorylation of the serine cluster whereas dephosphorylated or hyperphosphorylated serine cluster inhibits homooligomerzation. Phosphorylation of the serine cluster also regulated viral transcription. NP with de- or completely phosphorylated serine cluster was unable to mediate transcription. Only partially phosphorylated serine cluster supported viral transcription and replication.


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